清熱解肌顆粒中揮發(fā)油的初步質(zhì)量研究

劉 雪，崔 穎，黃順旺，王 浩，陳師農(nóng)，孫 備，呂 凌

(1．安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230012;

2．安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽合肥 230051)

清熱解肌顆粒為中藥復(fù)方新藥，其處方出自明代《傷寒六書》，由柴胡、羌活、白芷、生姜等藥材組成，具有解肌清熱之功效，主治感冒［1－2]。處方中的柴胡、羌活、白芷、生姜4味藥材均含有揮發(fā)油，其中，《中國藥典》規(guī)定羌活藥材含揮發(fā)油不得少于1．4%(mL·g－1)，文獻報道［3－6]，揮發(fā)油為上述 4味藥材的主要有效成分，其藥效與本制劑的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等藥效基本相符，因此，本制劑工藝采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，考慮到揮發(fā)油易逸散和氧化變質(zhì)，采用倍他環(huán)糊精包合工藝，以提高揮發(fā)油在制劑中的穩(wěn)定性［7－9]。鑒于中藥復(fù)方制劑中揮發(fā)油含量測定和薄層鑒別研究的文獻報道較少，同時，為了更好地控制本制劑的質(zhì)量和保證臨床療效，本文在通過氣—質(zhì)聯(lián)用色譜儀 (GCMS)對揮發(fā)油提取物成分進行歸屬鑒定的基礎(chǔ)上，運用GC法采用單指標(biāo)和總成分相結(jié)合的手段對制劑中的揮發(fā)油進行了含量測定，并進行薄層鑒別，從而達到有效控制其質(zhì)量的目的。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 梅特勒電子天平(上海梅特勒－托利多有限公司)，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國布魯克－道爾頓公司，MS．Workstation色譜工作站)，氣相色譜儀(Aglient7890A，F(xiàn)ID檢測器，Aglient中文工作站)，硅膠G板(100 mm×100 mm，薄層層析用，青島海洋化工廠分廠)，揮發(fā)油測定器(天長市金橋分析儀器廠)，GZX－9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1．2 試藥 柴胡、羌活、白芷、生姜等藥材購自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司，并經(jīng)安徽省食品藥品檢驗研究院陳師農(nóng)研究員鑒定;α-蒎烯對照品，批號110897－200502、β-蒎烯對照品，批號110827－201202、桉油精對照品，批號110788－201105(均由中國食品藥品檢定研究院提供);清熱解肌顆粒自制(批號:20140706、20140707、20140708);水為去離子水，乙酸乙酯，石油醚(30～60℃)、甲苯、環(huán)己烷等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 揮發(fā)油的薄層色譜鑒別［3]取清熱解肌顆粒50 g，照揮發(fā)油測定法(中國藥典2010年版一部附錄X D)提取揮發(fā)油，取油層，加乙酸乙酯0．5 mL將揮發(fā)油溶解后，作為供試品溶液。按處方配比取柴胡、羌活、白芷和生姜對照藥材，同法制成對照藥材溶液。另取β-蒎烯對照品和桉油精對照品，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含40 mg的溶液，作為對照品溶液。再按處方配比及制備工藝制成不含柴胡、羌活、白芷和生姜的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述5種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚30～60℃—乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與藥材揮發(fā)油、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 制劑中揮發(fā)油的薄層色譜鑒別圖

2．2 GC-MS 對揮發(fā)油提取物成分的鑒定［10]

2．2．1 色譜條件 色譜柱:DB－5 ms毛細(xì)管色譜柱 (30 m ×0．25 mm ×0．25μm，美國 HP公司);載氣:氮氣;流速:1．0 mL·min－1;柱溫:40℃(1 min)至 50℃ (速率 5℃ ·min－1)，50℃ (1 min)至74℃(速率4 ℃·min－1)，74 ℃至220℃(速率5℃·min－1，至 220℃保持 1 min);進樣口溫度:250℃;質(zhì)譜接口溫度:280℃;離子源溫度:280℃;電子轟擊電壓70 eV;全離子掃描，范圍33～350 m·z－1;進樣量:1．0μL;分流比:10∶1;運行時間:約 40 min。

2．2．2 供試品溶液的制備 取揮發(fā)油提取物約10 mg，置10 mL容量瓶中，加入乙酸乙酯適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．2．3 揮發(fā)油提取物鑒定 精密吸取供試品溶液1．0μL注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果共測定出13個主要色譜峰，鑒定出12個化合物。結(jié)果見表1和圖2。

表1 揮發(fā)油化學(xué)成分分析

圖2 揮發(fā)油的GC－MS色譜圖

2．3 揮發(fā)油含量測定［11]

2．3．1 色譜條件 色譜柱:Agilent HP－5毛細(xì)管色譜柱 (30 m ×0．25 mm ×0．25μm);載氣:氮氣;流速1．0 mL·min－1;柱溫:40 ℃(1 min)至 220 ℃(速率5℃·min－1，至220℃保持1 min);檢測器:FID，溫度250℃;進樣口溫度:240℃;進樣量:1．0 μL;分流比:10 ∶1;運行時間:約38 min。

2．3．2 對照品溶液的制備 分別精密稱取 α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精對照品 60．5、49．8、46．5 mg，置10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取各對照品貯備液適量至同一量瓶中，得到混合對照品溶液，使其濃度分別為 15、2．5、5 mg·L－1的溶液。

2．3．3 供試品溶液的制備 取本品10 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加水10 mL振搖使顆粒分散溶化，再精密加入乙酸乙酯10 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min后放置室溫，再稱定重量，用乙酸乙酯補足減失的重量，取上清液(乙酸乙酯層)，即得。

2．3．4 陰性對照溶液的制備 按處方配比稱取除柴胡、羌活、白芷、生姜藥材以外的其他藥材，按制備工藝和供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2．3．5 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液進樣，結(jié)果陰性對照溶液在對照品相應(yīng)位置上無色譜峰，說明其他成分對測定無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 清熱解肌顆粒揮發(fā)油專屬性GC色譜圖

2．3．6 線性關(guān)系考察 將“2．3．2”項下對照品貯備液，用乙酸乙酯逐級稀釋成系列濃度的混合對照品溶液，分別進樣1．0μL，以峰面積A為縱坐標(biāo)，以對照品濃度C(mg·L－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的回歸方程分別為Y=2．626 2X+0．720 3(r=1．000)、Y=2．526 0X+0．082 0(r=1．000)、Y=2．169 5X+0．045 4(r=1．000)，其線性范圍分別為 1．89 ～605．00，1．25 ～99．60，2．32 ～185．81 mg·L－1。

2．3．7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液分別于0、1．5、3、6、9、12、15、18 h(室溫，未避光)進樣，記錄供試品中 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精的峰面積，結(jié)果 α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的 RSD 分別為 1．01%、4．60%、1．92%，表明供試品溶液至少在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．8 精密度試驗 按“2．3．3”項下供試品溶液處理方法平行處理6份樣品，測定三種成分的峰面積，計算含量。結(jié)果 α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的RSD 分別為 1．32%、3．47%、1．41%(n=6)，表明該方法的精密度良好。

2．3．9 重復(fù)性試驗 取“2．3．2”項下配制的混合對照品溶液，按照“2．3．1”方法連續(xù)進樣5次，進行測定。結(jié)果α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精的RSD分別為0．87%、1．27%、0．50%(n=5)，表明該方法的重復(fù)性良好。

2．3．10 加樣回收率試驗 取已知含量樣品9份，每份10 g，精密稱定，分別加入 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精對照品貯備液適量(按含量的80%，100%，120%加入)，按“2．3．3”項下供試品溶液制備方法制備，進樣1．0μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

2．3．11 定量限試驗 取“2．3．2”項下對照品溶液，逐級稀釋。按照“2．3．1”方法測定，使當(dāng)信噪比S/N≥10時即可。結(jié)果 α-蒎烯、β-蒎烯、桉油精的定量限分別為 1．89、1．25、2．32 ng。

2．3．12 樣品含量測定 取3批同一工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，按“2．3．3”項下供試品溶液制備方法制備，按照“2．3．1”方法測定樣品中 α-蒎烯，β-蒎烯，桉油精的含量，其余鑒定成分均以α-蒎烯作為對照計算含量。結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

表3 三批樣品含量測定結(jié)果/%

3 討論

本處方中柴胡、羌活、白芷為多基原藥材［3]，本研究結(jié)合藥材使用情況固定了藥材基原及產(chǎn)地，北柴胡(Bupleurum chinense DC．)，產(chǎn)地為陜西;羌活(Notopterygium incisum Ting ex H．T．Chang)，產(chǎn)地為四川;白芷(Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm)Benth．Et Hook．f．)，產(chǎn)地為安徽。基原及產(chǎn)地的固定，使得藥材的揮發(fā)油含量和所含化學(xué)成分相對穩(wěn)定，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。

薄層鑒別試驗中，采用三種展開劑［石油醚30～60℃—乙酸乙酯(9∶1);石油醚—甲苯—乙酸乙酯(7∶6∶1．5);環(huán)己烷—乙酸乙酯 (9．5∶0．5)]［3，12－13]，結(jié)果 α-蒎烯對照品均有干擾斑點，因此暫選用β-蒎烯，桉油精作為制劑中揮發(fā)油薄層色譜鑒別的對照品，α-蒎烯的薄層鑒別有待于進一步研究。

GC-MS對揮發(fā)油提取物的鑒定中，由于β-蒎烯含量較少，在化學(xué)成分分析表中未給出分析，但在揮發(fā)油含量測定試驗中，通過對照品確定其保留時間;由于只獲得α-蒎烯、β-蒎烯和桉油精三種對照品，其他成分均未獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，最終采用外標(biāo)法計算樣品中上述三種成分的含量，測得結(jié)果這三種成分含量較低，因此以α－蒎烯作為對照計算揮發(fā)油總量(即 α-蒎烯，β-蒎烯，桉油精，樟烯，β-水芹烯，萜品烯，肉豆蔻醚，芹菜腦8種成分含量之和)。

樣品處理時通過考察單一因素變化對提取效果的影響，篩選出最佳提取方法。分別考察不加水、加水5 mL、加水10 mL以及樣品研磨處理四種方法，結(jié)果表明不加水處理造成顆粒不易溶解，但加水不足易產(chǎn)生乳化導(dǎo)致乙酸乙酯層不易分離，而顆粒經(jīng)研磨處理會造成揮發(fā)油含量降低，因此，選擇了本實驗中樣品的處理方法。

［1] 王 姝．柴葛解肌湯藥理作用的研究進展［J]．衛(wèi)生職業(yè)教育，2014，32(24):151 －152．

［2] 徐以亮．柴葛解肌湯配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J]．中國藥業(yè)，2012，21(18):49 －51．

［3] 國家藥典委員會．中國藥典(一部)［S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:170，236，97，97，382，389，34Ⅵ B，63 附錄 X D．

［4] 霍夢逸，劉 新，林 於，等．柴胡揮發(fā)油中有效解熱成分的研究［J]．藥物分析雜志，2013，33(7):1202 －1209．

［5] 高小坤．白芷揮發(fā)油鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用實驗研究［J]．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22(35):3880 －3882．

［6] 李 翔，王 敏．干姜揮發(fā)油的均勻設(shè)計提取和化學(xué)成分鑒定［J]．華北國防醫(yī)藥，2010，22(3):216 －218．

［7] 李 希，謝守德，張 嵩，等．羌活揮發(fā)油－β－環(huán)糊精制備工藝的研究［J]．中國中藥雜志，2002，27(2):108 －110．

［8] 李樹珍，官仕杰．八種中藥揮發(fā)油環(huán)β－環(huán)糊精包接物的穩(wěn)定性考察［J]．中國中藥雜志，1990，15(4):26 －28．

［9] 趙永亮，管景帥，溫金娥，等．β－環(huán)糊精研究及應(yīng)用進展［J]．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014，35(6):97－101．

［10]馬雯芳，譚建寧，徐東來，等．GC－MS測定姜油中－蒎烯、桉油精和龍腦的含量［J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(21):11030－11031．

［11]趙祥升，黃立標(biāo)，楊新全，等．肉豆蔻揮發(fā)油中α－蒎烯，β－蒎烯含量測定及動態(tài)分析［J]．海峽藥學(xué)，2012，24(8):57 －59．

［12]汪國華，張文惠．艾葉中桉油精的薄層色譜鑒別［J]．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，12(1):29．

［13]張林林，薛 健，劉東靜，等．油松節(jié)藥材質(zhì)量研究［J]．醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29(2):240 －242．