牦牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定

陳亞冰，符 梅，蘭道亮，林寶山，黃 偲，李 鍵*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041)

牦牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定

陳亞冰1，符 梅1，蘭道亮2，林寶山1，黃 偲1，李 鍵2*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041)

本研究旨在建立牦牛乳腺上皮細(xì)胞系，并對建立的細(xì)胞系生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,采用組織塊種植法，分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞；通過胰酶消化法純化細(xì)胞；利用免疫熒光及Western blot技術(shù)對其進(jìn)行鑒定；脂質(zhì)體介導(dǎo)法將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞中，熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白基因表達(dá)；金黃色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(AnnexinV/PI 雙染法)檢測乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，RT-PCR檢測感染細(xì)胞中抗菌肽以及凋亡因子表達(dá)。結(jié)果表明，分離純化獲得牦牛乳腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞角蛋白18表達(dá)呈陽性，波形蛋白表達(dá)呈陰性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是上皮細(xì)胞并且沒有成纖維細(xì)胞污染；β-酪蛋白表達(dá)呈陽性，說明建立的乳腺上皮細(xì)胞具有一定的泌乳功能；熒光顯微鏡能夠檢測到綠色熒光蛋白表達(dá)，表明EGFP基因成功導(dǎo)入了乳腺上皮細(xì)胞；金黃色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮細(xì)胞3 h后， Annexin V/PI 雙染法檢測發(fā)現(xiàn)感染組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異顯著(P<0.05)；感染細(xì)胞中TAP(P<0.01)、BNBD5(P<0.01)及BAX(P<0.01)表達(dá)量明顯增高，BCL-2(P<0.05)表達(dá)量降低。綜上表明，本研究成功建立了一株穩(wěn)定的牦牛乳腺上皮細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠作為研究牦牛乳腺發(fā)育及分化的體外研究模型。

牦牛；乳腺上皮細(xì)胞；培養(yǎng)；鑒定

保留乳腺特異性功能的乳腺上皮細(xì)胞系可以作為研究乳腺發(fā)育、分化以及乳腺生物反應(yīng)器的理想模型[1-4]。牦牛(Bosgrunniens)是主要分布于海拔3 000 m以上青藏高原及其周邊高寒地區(qū)的物種，牦牛在藏區(qū)人民的日常生活中扮演著重要角色。與奶牛相比，牦牛年產(chǎn)奶量僅250 kg左右，但牦牛奶品質(zhì)較高，干物質(zhì)占到17.31%～18.40%。選擇性育種及現(xiàn)代飼養(yǎng)技術(shù)雖然能夠有助于提高牦牛的產(chǎn)奶量，但這種產(chǎn)量的增加是有限的。探究牦牛特殊泌乳機(jī)制能夠為提高牦牛泌乳量提供理論基礎(chǔ)，而牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立可為研究牦牛泌乳調(diào)控機(jī)制提供理想的體外模型。在人[5]、鼠[6]、羊[7-8]、奶牛[9-10]、水牛[11-12]均已建立乳腺上皮細(xì)胞系，所建立的乳腺上皮細(xì)胞既可以用于研究乳蛋白基因表達(dá)及乳汁分泌機(jī)制，又可以作為研究干乳期細(xì)胞凋亡及乳腺退化的寶貴材料，同時還可以作為乳腺特異性表達(dá)載體的檢測系統(tǒng)，并用于評價乳腺特異性表達(dá)載體的有效及合理性[13]。由于物種的差異性，針對某種物種的乳腺上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的研究并不能完全適用于其他物種，因此，牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立對于研究牦牛乳腺生物學(xué)具有重要作用，也可以為構(gòu)建基因組文庫、體細(xì)胞克隆及基因遺傳多樣性等研究提供理想生物學(xué)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺組織采自成都市青白江屠宰場屠宰的泌乳后期健康牦牛。

1.2 主要試劑

EGFP-N1載體購自Promega公司；甘露醇培養(yǎng)基購自青島拓?fù)渖锕?；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；FBS及胰酶購自GIBCO公司；Hochest 33342染料購自碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12及青鏈霉素雙抗購自Hyclone公司；氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、L-谷氨酰胺、EGF及孕酮購自Sigma公司；Trizol 購自Invitrogen 公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Ferments 公司。

1.3 乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

剪取牦牛乳腺組織，切取少量乳腺組織塊，置于含有100 μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DPBS中，于冰盒中迅速帶回實驗室。在超凈工作臺中去除脂肪及結(jié)締組織，用DPBS反復(fù)沖洗3～5遍，直到洗干凈為止。在含有微量培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將乳腺組織盡量剪成大小為1 mm3的組織塊。將組織塊接種到培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 h左右，盡量讓細(xì)胞貼壁，然后加入適量培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔2 d 更換1次，待細(xì)胞基本長滿培養(yǎng)皿底壁，吸去原培養(yǎng)基，用DPBS清洗細(xì)胞3次，加入0.25%的胰酶，采用差時胰酶消化法分離純化獲得乳腺上皮細(xì)胞。

1.4 免疫熒光染色鑒別角蛋白18(Cytokeratin 18)及波形蛋白(Vimentin)

細(xì)胞免疫熒光染色鑒定細(xì)胞是否表達(dá)角蛋白18(上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白)、波形蛋白(成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白)，從而驗證細(xì)胞是上皮細(xì)胞并檢驗是否被成纖維細(xì)胞污染。消化傳代的上皮細(xì)胞按每孔5×104個細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞鋪滿80%～90%時，吸去培養(yǎng)液，用DPBS洗滌2次； 4%多聚甲醛室溫固定30 min，DPBS沖洗細(xì)胞3次；用0.5%的Triton-100 通透處理細(xì)胞5 min，DPBS洗3次；1% BSA封閉 20 min，去除封閉液，甩干；加適量一抗，4 ℃過夜孵育；吸去一抗，DPBS沖洗3次，加入 FITC標(biāo)記二抗，作用1 h，DPBS沖洗3次；Hochest33342避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 Western-blot 檢測β-酪蛋白的表達(dá)

牦牛乳腺上皮細(xì)胞長到80%～90%豐度時，分成2組分別培養(yǎng)：一組加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(90% DMEM/F12+10% FBS+5 μg·mL-1胰島素+5 μg·mL-1孕酮+5 ng·mL-1表皮生長因子+1 μg·mL-1孕酮+5 μg·mL-1ITS+1 μg·mL-1氫化可的松+1 00 μg·mL-1青、鏈霉素 )；另一組只加入正常的生長培養(yǎng)基(90% DMEM/F12+10% FBS+1 00 μg·mL-1青、鏈霉素)。細(xì)胞培養(yǎng)后，根據(jù)Qiagen公司的蛋白質(zhì)提取試劑盒說明書分別提取誘導(dǎo)組及非誘導(dǎo)組乳腺上皮細(xì)胞總蛋白質(zhì)，提取總蛋白，Western blot檢測酪蛋白的表達(dá)，另外提取乳腺組織、成纖維細(xì)胞總蛋白分別作為陽性、陰性對照組。

1.6 EGFP-N1轉(zhuǎn)染牦牛乳腺上皮細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前24 h，將牦牛乳腺上皮細(xì)胞以5×104個·mL-1密度接種于24孔板，每孔加入500 μL培養(yǎng)基(含血清及無抗生素)，待細(xì)胞長到80%匯合時，備用。轉(zhuǎn)染前2 h，細(xì)胞換液，加入無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)基；將3 μL脂質(zhì)體加入到50 μL DMEM/F12中稀釋，溫和混勻，室溫作用5 min；將 1 μg質(zhì)粒加入到50 μL DMEM/F12中稀釋，室溫作用5 min；混合稀釋的質(zhì)粒和脂質(zhì)體，室溫靜置20 min，形成DNA-脂質(zhì)體混合物；將混合液加到24孔板中，4 h后換用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，加入G418對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選。

1.7 金黃色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮細(xì)胞

金黃色葡萄球菌(ATCC29525)于甘露醇培養(yǎng)基中劃線并37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于甘露醇肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，3 000 r·min-1，離心5 min收集菌體，收集的菌體用DMEM/F12重懸。將重懸的菌體以MOI=100∶1的比例接種于生長至85% 的乳腺上皮細(xì)胞中侵染3 h，同時設(shè)置以不被菌體感染細(xì)胞作為對照組。

1.7.1 金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牦牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡檢測 采用 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，具體流程：侵染試驗完成后，收集上清至 15 mL 離心管中；胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞成單個細(xì)胞懸液；1 000 r·min-1離心 3 min，收集消化的細(xì)胞并與上清中的細(xì)胞合并。調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)到1×106個·mL-1，取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，室溫下避光孵育 15 min，1 h 內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.7.2 定量PCR檢測抗菌肽及凋亡因子表達(dá) 細(xì)胞侵染3 h后移除培養(yǎng)液，DPBS洗2次，向培養(yǎng)皿中加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎脽晒舛縋CR檢測抗菌肽、凋亡因子在細(xì)胞中的表達(dá)量。定量引物序列見表1，其中定量PCR反應(yīng)體系為15 μL：SYBR Premix Ex TaqTM II 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，39個循環(huán)，添加熔解曲線；每個組織樣品進(jìn)行3個重復(fù)，GAPDH基因被選用作為內(nèi)參基因。

表1TAP、BNBD5、BAX及BCL-2基因定量引物序列

Table 1 RT-PCR primers used in this study forTAP，BNBD5，BAX，andBCL-2 genes

基因Genes引物序列(5'-3')Sequencesofprimers退火溫度/℃Theannealingtemperature擴(kuò)增片段長度/bpLengthofamplifiedfragmentTAPCTCCATCACCTGCTCCTCGGCCCAACACAGGTGCCAA58.5160BNBD5GCCAGCATGAGGCTCCATCTTGCCAGGGCACGAGATCG58143BAXTGGACATTGGACTTCCTTCGTGAGCACTCCAGCCACAAAG58100BCL-2AGGGACGGGGTGAACTGGCATACAGCTCCACAAGG60193GAPDHGCTGGTGCTGAGTAGTTGGTGTCTTCTGGGTGGCAGTGATGG60220

熒光定量結(jié)果采用相對定量的2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Spass 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 牦牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 組織塊接種7 d后，可見有成纖維細(xì)胞從組織塊中游離出來(圖1A)，繼續(xù)培養(yǎng)10 d以后，有上皮細(xì)胞長出來(圖1B)。胰酶差時消化獲得成纖維細(xì)胞及乳腺上皮細(xì)胞，獲得的成纖維細(xì)胞成扁纖維狀結(jié)構(gòu)(圖1C)，純化后的上皮細(xì)胞呈多種形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度比較低的時候，乳腺上皮細(xì)胞呈島嶼狀生長(圖1D)，細(xì)胞長到匯集到80%時呈現(xiàn)鵝卵石形(圖1E)，此時不傳代，讓細(xì)胞繼續(xù)生長到單層細(xì)胞鋪滿時會看到細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則多角形(圖1F)。當(dāng)培養(yǎng)基加入誘導(dǎo)因子后，乳腺上皮細(xì)胞周邊會出現(xiàn)乳滴(圖1G)，乳滴不斷向外分泌形成維管狀(圖1H)。該細(xì)胞能夠連續(xù)傳代60代以上，并且細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生變化，經(jīng)液氮泠凍保存復(fù)蘇后的細(xì)胞仍保持正常細(xì)胞形態(tài)(圖1I)。

2.1.2 Western blot檢測牦牛乳腺上皮細(xì)胞的乳蛋白表達(dá) 采用Western blot技術(shù)探測β-酪蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示,建立的牦牛乳腺上皮系具有合成牛奶蛋白的能力，另外，培養(yǎng)基中添加的誘導(dǎo)因子能夠增強(qiáng)乳腺上皮細(xì)胞分泌乳蛋白能力(圖2)。

A.組織塊周圍游離出成纖維細(xì)胞；B.乳腺上皮細(xì)胞長出；C.純化后的成纖維細(xì)胞；D.上皮細(xì)胞呈現(xiàn)島狀；E.上皮細(xì)胞呈現(xiàn)鵝卵石形；F.上皮細(xì)胞呈不規(guī)則多角形；G.乳腺上皮細(xì)胞分泌出乳滴；H.腔狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；I:復(fù)蘇細(xì)胞A.Fibroblasts elongated from tissues；B.Growth of mammary epithelial cells；C.Purification of fibroblasts；D.Yak mammary epithelial cells formed islands；E.Oval morphology of yak mammary epithelial cells；F.Irregular polygon morphology of yak mammary epithelial cells；G.Yak mammary epithelial cells contained milk drops；H.Tubular structure；I.Morphology of resuscitated yak mammary epithelial cells圖1 牦牛乳腺上皮細(xì)胞的各種形態(tài)Fig.1 The morphology of yak mammary epithelial cells

1.牦牛乳腺組織；2.成纖維細(xì)胞；3.牦牛乳腺上皮細(xì)胞(基礎(chǔ)培養(yǎng)基);4.牦牛乳腺上皮細(xì)胞(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)1.Mammary gland tissue of yak；2.Fibroblasts；3.Yak mammary epithelial cells cultured in basmal medium；4.Yak mammary epithelial cells cultured in induction medium圖2 Western blot鑒定β-casein表達(dá)Fig.2 The identification of β-casein by Western blot

2.1.3 牦牛乳腺上皮細(xì)胞的免疫熒光鑒定 應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色的方法檢測了乳腺上皮細(xì)胞Cytokeratin 18及Vimentin蛋白表達(dá)，倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)果顯示該細(xì)胞表達(dá)Cytokeratin 18蛋白(圖3)，Vimentin蛋白呈陰性(圖3)，進(jìn)一步在蛋白水平上驗證培養(yǎng)的細(xì)胞是乳腺上皮細(xì)胞，并沒有成纖維細(xì)胞污染。

2.2 EGFP-N1轉(zhuǎn)染牦牛乳腺上皮細(xì)胞

牦牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP-N1 12 h后，可見部分細(xì)胞發(fā)綠色熒光，分布較散，且熒光比較弱(圖4A)。24 h后陽性細(xì)胞明顯增多，低倍鏡下看到轉(zhuǎn)染效率有30%左右，經(jīng)G418篩選(600 μg·mL-1)，第3 天大量細(xì)胞開始死亡，10 d后可看到有單克隆細(xì)胞產(chǎn)生(圖4B)，大約14 d，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在G418作用下全部死亡，此時G418濃度減半(300 μg·mL-1)繼續(xù)篩選培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿單層后擴(kuò)大培養(yǎng)(圖4C)。

A.Cytokeratin 18蛋白免疫熒光圖；B.細(xì)胞核免疫熒光圖；C.Cytokeratin 18蛋白與細(xì)胞核免疫圖合并；D.Vimentin蛋白免疫熒光圖；E.細(xì)胞核免疫熒光圖；F.Vimentin蛋白與細(xì)胞核免疫圖合并A.Fluorecent image of cells incubated with anti-cytokeratin 18 antibody；B.Fluorecent image of cell nucleus；C.Mergence of fluorescent images of cytokeratin 18 and cell nucleus；D.Fluorecent image of cells incubated with vimentin antibody；E.Fluorecent image of cell nucleus；F.Mergence of fluorescent images of vimentin and cell nucleus圖3 免疫熒光鑒定角蛋白8及角蛋白18 400×Fig.3 The immunofluorescence assay of cytokeratin 8 and cytokeratin 18 400×

A.陽性細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白；B.G418篩選后陽性單克隆細(xì)胞；C.鋪滿平板陽性細(xì)胞A.Positive cell expressing the EGFP；B.The positive monoclonal cells after G418 screening；C.The positive cells overspreading the plate圖4 綠色熒光蛋白在牦牛上皮細(xì)胞系中表達(dá)Fig.4 The expression of EGFP in yak mammary epithelial cell

2.3 金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牦牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡檢測

2.3.1 普通光學(xué)顯微鏡下觀察侵染后細(xì)胞凋亡情況 金黃色葡萄球菌侵染牦牛乳腺上皮細(xì)胞3 h后，顯微鏡下可看到對照組細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接緊密；ATCC29525感染的上皮細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，且細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接松散，細(xì)胞有皺縮的趨勢，但細(xì)胞膜完整。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測乳腺上皮細(xì)胞凋亡結(jié)果 為了進(jìn)一步證明金黃色葡萄球菌可以誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞儀(AnnexinV/PI雙染法)檢測細(xì)胞凋亡情況。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此活細(xì)胞不被染色，早期凋亡的細(xì)胞僅被Annexin-FITC染色，晚期凋亡細(xì)胞可被Annexin/PI雙染色。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限是凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞。結(jié)果顯示(圖5)，與對照組相比，金黃色葡萄球菌感染后的上皮細(xì)胞在早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于對照組，凋亡率差異顯著(P<0.05)。

B1.壞死細(xì)胞；B2.繼發(fā)性壞死細(xì)胞；B3.活細(xì)胞；B4.早期凋亡細(xì)胞B1.Necrotic cells；B2.Secondary necrotic cells；B3.Viable cells；B4.Early apoptotic cells圖5 AnnexinV/PI 雙染法分析細(xì)胞凋亡Fig.5 Analysis of apoptosis cell by AnnexinV/PI

2.3.3 抗菌肽及凋亡因子基因表達(dá)量檢測分析

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌感染乳腺上皮細(xì)胞前后抗菌TAP、BNBD5基因及凋亡因子BAX、BCL-2基因表達(dá)量變化。結(jié)果顯示(圖6)，感染組細(xì)胞BNBD5及TAP基因表達(dá)量高于對照組(P<0.01)；感染組細(xì)胞BAX基因表達(dá)量高于對照組(P<0.01)，而BCL-2基因表達(dá)量低于對照組(P<0.05)。

CG.對照組；S.aureus treated.金黃色葡萄球菌侵染組；*.P<0.05;**.P<0.01CG.Control group；S.aureus treated.The cells infected by S.aureus；*.P<0.05；**.P<0.01圖6 目的基因RT-PCR定量結(jié)果Fig.6 The relative expression of related genes

3 討 論

3.1 牦牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

有泌乳功能的乳腺上皮細(xì)胞系不僅可以用來研究乳蛋白基因表達(dá)及泌乳機(jī)制，還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變?nèi)橹某煞?，獲得具有生物活性成分的重要外源產(chǎn)物[13]，但通過乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)能達(dá)到商品化生產(chǎn)所需的為數(shù)不多。因此，本研究建立正常乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研究上皮細(xì)胞的增殖和分化以及乳腺生物反應(yīng)器提供合適的細(xì)胞平臺。

動物細(xì)胞原代培養(yǎng)主要有兩種方法，一是組織塊培養(yǎng)法，即從貼壁的組織塊周圍長出細(xì)胞，此種方法耗時長，但容易得到較純的乳腺上皮細(xì)胞，已被證明適用于乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)；二是膠原酶消化法收集單細(xì)胞懸液，此種方法獲得乳腺上皮細(xì)胞的時間短，但上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞夾雜生長，不利于乳腺上皮細(xì)胞的純化[14-15]。因此，本研究采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)牦牛乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞角蛋白18是上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白，波形蛋白是成纖維細(xì)胞特異標(biāo)記蛋白，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示純化的細(xì)胞為牦牛乳腺上皮細(xì)胞。在體外，一些激素已被證明能影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞分泌乳汁。表皮生長因子(EGF)對細(xì)胞具有很強(qiáng)的促分裂活性和促生長作用[16]，胰島素能增加乳腺上皮細(xì)胞的貼壁率和伸展[16]，氫化可的松對維持乳腺上皮細(xì)胞的生長也是必需的[17]。本研究選用含10%的胎牛血清、5 μg·mL-1的胰島素、5 μg·mL-1EGF、1 μg·mL-1氫化可的松、100 μg·mL-1青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)液，細(xì)胞活力旺盛，生長良好，能夠傳至60代以上，說明此培養(yǎng)液適合乳腺上皮細(xì)胞的生長。β-酪蛋白的合成與分泌是功能性乳腺上皮細(xì)胞體外成功的標(biāo)志，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞能夠分泌酪蛋白，證明培養(yǎng)的牦牛乳腺上皮細(xì)胞具有分泌乳汁能力。

3.2 牦牛乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP-N1

小鼠曾被選作構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體的模式動物，但小鼠乳腺上皮細(xì)胞分泌的乳汁量有限，而牛與羊分泌的乳汁量較多，因此，牛羊乳腺上皮細(xì)胞可被選作乳腺生物反應(yīng)器[18-19]。本研究采用EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牦牛乳腺上皮細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到30%，說明牦牛乳腺上皮細(xì)胞具有整合外源基因的能力，可作為表達(dá)外源基因的生物反應(yīng)器。

3.3 金黃色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，奶牛乳房炎可導(dǎo)致牛奶質(zhì)量、產(chǎn)量下降從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，由金黃色葡萄球菌感染引起的牛乳房炎的致病機(jī)制尚不清楚，因此對發(fā)病機(jī)理的研究將是解決上述問題關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染牦牛乳房上皮細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)抗菌肽TAP及BNBD5，這與前人研究結(jié)果一致[20-21]。BAX和BCL-2分別作為凋亡因子及抗凋亡因子，其相對表達(dá)量調(diào)控細(xì)胞對凋亡刺激不同反應(yīng)，即誘導(dǎo)或抑制凋亡。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌感染牦牛乳腺上皮細(xì)胞后，BAX基因表達(dá)升高，BCL-2基因表達(dá)量降低。流式細(xì)胞儀檢測感染前后細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示感染后的細(xì)胞具有較高的凋亡率。崔新潔等[22]采用金黃色葡萄球菌感染了牛乳腺上皮細(xì)胞，感染后的牛乳腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)了細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)邊緣化和細(xì)胞漿內(nèi)空泡增多等典型凋亡特征，研究并證明了金黃色葡萄球菌能夠誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡，并推測凋亡通路可能涉及 Caspase 3 和 Caspase 8 參與的外源性凋亡途徑[22-23]。本研究建立的乳房上皮細(xì)胞能夠用于金黃色葡萄球菌侵染研究，為下一步研究牦牛乳房炎提供了一個良好的體外研究模型。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了一株穩(wěn)定的牦牛乳房上皮細(xì)胞系，該細(xì)胞系保留了乳房上皮細(xì)胞系的典型細(xì)胞特征，暗示了該細(xì)胞系能夠作為研究牦牛乳腺發(fā)育及分化的體外研究模型。

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(編輯 程金華)

Culture and Identification of Yak Mammary Epithelial Cells

CHEN Ya-bing1，F(xiàn)U Mei1，LAN Dao-liang2，LIN Bao-shan1，HUANG Cai1，LI Jian2*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041,China； 2.CollegeofTibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041,China)

The present study was carried out to establish yak mammary epithelial cell (YMEC) line and identify its biological characteristic，which was separated using tissue explants method，purified by selective trypsinization，characterized by immunofluorescence and Western blot assay.TransfectingEGFP-N1 gene into cells using lipofection to examine whether foreign genes could be transfected into YMECs，fluorescence microscope was used to detect the expression ofEGFPgene.Lastly，flow cytometry was used to evaluate the apoptosis level of cells with Annexin V/PI double staining and RT-PCR was used to examine gene expression of antibacterial peptide and apoptosis factors to determine the effect ofStaphylococcusaureusinfection on YMECs.Immunofluorescence assay results proved established cell line could express cytokeratin 18 rather than vimentin，indicating no fibroblast existing in epithelial cells.Positive expression of β-casein in YMECs demonstrated cultured cells could synthesize and secrete mammary- specific milk protein.Moreover，we detected EGFP protein in transfected YMECs by fluorescence microscope，showingEGFPgene was successfully transfected into the YMECs.After YMECs were challenged with forStaphylococcusaureusfor 3 h，the apoptosis level of mammary epithelial cells was significantly up-regulated(P<0.05).Furthermore，the expression ofTAP(P<0.01)，BNBD5(P<0.01)andBAX(P<0.01)genes increased; whereas that ofBCL-2 gene decreased(P<0.05).To conclude，we successfully established a stable yak mammary epithelial cell line，which can be used as a useful modelinvitrofor study of yak mammary gland development and differentiation.

yak；mammary epithelial cells；culture；characterization

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.009

2014-07-31

國家公益行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203009)

陳亞冰(1989-)，男，河南許昌人，碩士生，主要從事動物免疫機(jī)制研究，E-mail: xccyb 916@163.com

*通信作者：李 鍵，教授，博士，主要從事牦牛育種研究，E-mail: lijian@swun.cn

S823.8+5；S813

A

0366-6964(2015)01-0069-08