雞KLF3基因的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響研究

王海霞，張志威,2，賀 綦，王 寧，王宇祥，曹志平，李 輝*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030； 2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832000)

雞KLF3基因的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響研究

王海霞1，張志威1,2，賀 綦1，王 寧1，王宇祥1，曹志平1，李 輝1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030； 2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832000)

為研究雞KLF3(GallusgallusKrüppel-like factor 3，gKLF3)基因的表達(dá)規(guī)律及其對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響，利用qRT-PCR檢測(cè)了其在肉雞脂肪組織和脂肪細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，并利用基因過表達(dá)技術(shù)研究gKLF3基因?qū)χ炯?xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示，gKLF3在2～10周齡肉雞腹部脂肪組織中持續(xù)表達(dá)，10周齡高脂肉雞腹部脂肪組織gKLF3表達(dá)量顯著高于低脂肉雞(P<0.05)；gKLF3在雞成熟脂肪細(xì)胞的表達(dá)量低于前脂肪細(xì)胞(P<0.01)；體外培養(yǎng)的雞前脂肪細(xì)胞經(jīng)油酸誘導(dǎo)分化后，gKLF3基因表達(dá)量均有低于對(duì)照組的趨勢(shì)；過表達(dá)gKLF3基因有抑制脂肪細(xì)胞分化，以及抑制C/EBPα、FAS基因表達(dá)(P<0.01)的趨勢(shì)。研究結(jié)果表明，gKLF3基因在雞腹部脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其可能是通過抑制C/EBPα、FAS基因表達(dá)進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞分化實(shí)現(xiàn)的。

雞；KLF3基因；脂肪細(xì)胞分化；基因表達(dá)

Krüppel-like factor 3(KLF3)具有3個(gè)典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，是Sp1/KLFs蛋白家族的一個(gè)成員，早在1996年，從小鼠紅細(xì)胞(Murine erythroid cells)中克隆得到[1]。因?yàn)樵谄銷端具有較多的堿性氨基酸，所以KLF3又被稱為堿性KLF因子(Basic Krüppel like factor，bKLF)[1]。目前，KLF3已經(jīng)被證實(shí)在哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞生成[2]、免疫反應(yīng)[3]、自噬作用[4]、心肌細(xì)胞分化[5]和脂肪細(xì)胞分化[6]中發(fā)揮重要作用。

KLF3基因敲除小鼠(KLF3-/-)比正常小鼠擁有較少的白色脂肪組織，并且附睪脂墊中的脂肪細(xì)胞無論是數(shù)量，還是體積都小于正常小鼠[6-7]。細(xì)胞水平的研究證實(shí)KLF3在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。3T3-L1前脂肪細(xì)胞系的研究表明，KLF3基因的表達(dá)量隨著脂肪細(xì)胞的分化而下降，強(qiáng)制表達(dá)KLF3基因抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化[6]，進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，KLF3通過抑制C/EBPα基因的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞分化。在秀麗隱桿線蟲中的研究表明，KLF3通過調(diào)控脂肪酸去飽和途徑基因的表達(dá)水平，參與調(diào)控維持正常脂肪酸復(fù)合物的形成[8]； 此外，KLF3是調(diào)控脂蛋白組裝、分泌和脂肪酸β-氧化的重要基因[9]。

目前還沒有關(guān)于KLF3基因在鳥類中的研究報(bào)道。本研究以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂系為試驗(yàn)材料，利用qRT-PCR的方法檢測(cè)gKLF3基因在2～10周齡高低脂系肉雞腹部脂肪組織、12日齡Arbour Acres(AA)仔雞成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞，以及脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)特點(diǎn)；同時(shí)，通過基因過表達(dá)試驗(yàn)研究了gKLF3基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的影響，為進(jìn)一步研究gKLF3基因調(diào)控脂肪分化的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高低脂選擇系第11世代2～10周齡公雞[10]。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高脂系、低脂系各取3只為試驗(yàn)材料，采集新鮮的腹脂樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2日齡的AA肉仔雞由本課題組飼養(yǎng)。雞KLF3基因過表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-myc-gKLF3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 雞前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞分離 取12日齡AA肉仔雞公雞，超凈臺(tái)中取腹部脂肪組織(腹部及肌胃周圍脂肪組織)放入裝有磷酸鹽緩沖液(PBS)的平皿中；用PBS將脂肪組織洗2遍，盡量除去血管和筋膜，用眼科剪剪碎組織，大約剪到1 mm3體積大小；用0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液消化組織，37 ℃消化65 min(每5 min搖勻1次)；消化完畢，加入全培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打，靜置分層，取上層油狀物下的絮狀物即為成熟脂肪細(xì)胞，其余部分分別經(jīng)100和600目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液分裝入離心管中，2 000 r·min-1離心10 min；棄去上清，加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，室溫靜置10 min后，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，獲得的沉淀即前脂肪細(xì)胞[11]。

1.2.2 雞前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 將分離的雞前脂肪細(xì)胞沉淀加入適量的全培養(yǎng)基重懸、吹勻，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，一般4～5 d長(zhǎng)滿，即可傳代；當(dāng)傳代培養(yǎng)的雞前脂肪細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有160 μmol·L-1油酸濃度的培養(yǎng)基)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每2 d換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照TRIzol 試劑(Invitrogen)說明書提取雞脂肪組織、成熟脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的總RNA。

1.2.4 油紅O提取比色 在雞前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的24、72、120 h，分別棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，用10%甲醛固定30 min；然后用PBS洗3次，蒸餾水洗3次，再用0.5%的油紅O染色液染色40 min；棄去多余的染色液，用PBS沖洗3次，室溫干燥；加入100%異丙醇溶解細(xì)胞中的油紅O，15 min后用分光光度計(jì)(510 nm)記錄光吸收值。

1.2.5半定量PCR 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)gKLF3基因預(yù)測(cè)序列XM_427367，利用Primer premier 5.0結(jié)合UCSC雞基因組數(shù)據(jù)庫(kù)跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)gKLF3基因表達(dá)分析引物，以gGAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，半定量PCR用到的引物詳見表1。擴(kuò)增片段大小gKLF3基因?yàn)?76 bp，gGAPDH基因?yàn)?85 bp。循環(huán)次數(shù)分別為28和25。以脂肪組織和脂肪細(xì)胞的cDNA為模板，擴(kuò)增片段，瓊脂糖凝膠電泳獲得電泳圖片，利用Quantity one Bio-rad軟件檢測(cè)基因電泳條帶的積分光密度IOD(Integrated option density，IOD)值?；虻南鄬?duì)表達(dá)量：

表1 用于PCR的引物

Table1PrimersusedforPCR

基因Gene引物(5'-3')PrimergKLF3F:CCAGCCAGTTCCTTTCATR:ACTTCCTGCGGAGACAATC/EBPαF:AGCTCGACCCGCTGTACR:TGTCTTTTTGGATTTGCFASF:AAGGAGGAAGTCAACGGR:TTGATGGTGAGGAGTCGβ-actinF:TCTTGGGTATGGAGTCCTGR:TAGAAGCATTTGCGGTGGgGAPDHF:CTGTCAAGGCTGAGAACGR:GATAACACGCTTAGCACCA

1.2.7 Western blot 待細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間，棄培養(yǎng)基，室溫下用PBS清洗細(xì)胞。然后向6孔板中加入細(xì)胞裂解液(RIPA Buffer)(每孔0.15 mL)，放置于冰上，輕輕搖動(dòng)，作用15 min。裂解完成后，將含有細(xì)胞的裂解液移至1.5 mL離心管中。10 000 r·min-14 ℃離心10 min后，將上清(細(xì)胞總裂解物)轉(zhuǎn)至新的離心管，與等體積凝膠加樣緩沖液(2×)混合，在100 ℃加熱3～5 min使蛋白質(zhì)變性。每個(gè)樣品取10～20 μL，采用BIO-RAD 的Mini-PROTEAN3電泳系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，采用BIO-RAD的Mini Trans-Blot將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于封閉液(5%脫脂乳的PBST)，室溫反應(yīng)1 h，或4 ℃過夜。洗去膜上的封閉液，將膜孵育在含一抗(Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody)的PBST溶液，置于搖床上，室溫反應(yīng)1 h；洗膜后將膜孵育在含二抗(Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated)的PBST溶液；再次洗膜后常規(guī)ECL顯色。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照羅氏FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑操作說明書進(jìn)行。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析采用Student-t，數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1gKLF3基因在高低脂系11世代2～10周齡肉雞脂肪組織的表達(dá)分析

利用半定量PCR分析了gKLF3基因在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞高、低脂系11世代2～10周齡肉雞脂肪組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，gKLF3在2～10周齡肉雞腹部脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，10周齡時(shí)，高脂肉雞腹部脂肪組織gKLF3表達(dá)水平顯著高于低脂肉雞(P<0.05，圖1)。

2.2 雞脂肪細(xì)胞中g(shù)KLF3基因的表達(dá)規(guī)律分析

利用qRT-PCR方法分析AA肉雞前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中g(shù)KLF3基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，gKLF3基因在雞前脂肪細(xì)胞(Stromal-vascular cell，SV)中的表達(dá)量高于成熟脂肪細(xì)胞(Fat cell，F(xiàn)C)(P<0.01， 圖 2A)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的雞前脂肪細(xì)胞經(jīng)油酸誘導(dǎo)分化后，gKLF3基因的表達(dá)量在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24、48、72和96 h)均有低于對(duì)照組(未經(jīng)油酸誘導(dǎo))的趨勢(shì)，但沒有達(dá)到顯著水平(圖 2B)。

2.3 過表達(dá)gKLF3對(duì)雞前脂肪細(xì)胞分化的影響

為了進(jìn)一步研究gKLF3基因在雞前脂肪細(xì)胞分化過程中的作用，本研究利用過表達(dá)技術(shù)分析了gKLF3基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的影響。在雞前脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV-myc-gKLF3和pCMV-myc(Empty Vector，EV)，48 h后回收細(xì)胞，用myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示pCMV-myc-gKLF3質(zhì)粒能在前脂肪細(xì)胞中成功表達(dá)蛋白(圖3A)。將雞KLF3基因過表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-myc-gKLF3)轉(zhuǎn)染到原代培養(yǎng)的雞前脂肪細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，加入油酸誘導(dǎo)細(xì)胞分化，油紅O提取比色結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)后的24、72和120 h，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)gKLF3基因的雞前脂肪細(xì)胞中脂滴沉積出現(xiàn)減少的趨勢(shì)，但沒有達(dá)到顯著水平(圖3B)。

柱狀圖表示gKLF3的相對(duì)表達(dá)量(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，*表示差異顯著(P<0.05)The diagrams show the relative expression of gKLF3 gene(Mean±SD).* means significant difference(P<0.05)圖1 gKLF3基因在脂肪組織發(fā)育過程中的表達(dá)Fig.1 Tissue expression pattern of gKLF3 gene in abdominal fat tissue during development

A.KLF3基因在原代分離(未經(jīng)培養(yǎng))的雞前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律；B.KLF3基因在油酸誘導(dǎo)分化的前脂肪細(xì)胞和對(duì)照組(未經(jīng)油酸誘導(dǎo)分化)中的表達(dá)規(guī)律。**.差異極顯著(P<0.01)。下同A.KLF3 mRNA expression in chicken preadipocytes(SV) and mature adipocytes(FC) were detected；B.KLF3 mRNA expression in preadipocytes which induced into differentiation by oleate and control group(which not induced into differentiation) was detected .** indicates significant difference(P<0.01).The same as below圖2 gKLF3基因在雞前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中表達(dá)特性Fig.2 Expression characteristics of gKLF3 gene in chicken preadipocytes and adipocytes

2.4 過表達(dá)gKLF3基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響

為了分析gKLF3基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的影響，利用qRTPCR檢測(cè)了脂肪細(xì)胞分化過程的標(biāo)志基因(FAS、C/EBPα)的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)gKLF3基因，在24 h顯著抑制C/EBPα基因的表達(dá)(P<0.01)，在72 h顯著抑制FAS、C/EBPα基因的表達(dá)(P<0.01，圖4)。

3 討 論

KLF家族的成員在哺乳動(dòng)物脂肪發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[12-14]。在3T3-L1細(xì)胞系中的研究顯示，KLF3是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子，但是KLF3基因敲除小鼠的脂肪組織減少[6]，表明了KLF3在脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有多個(gè)調(diào)控功能，目前還沒有關(guān)于鳥類KLF3的研究報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，gKLF3基因在高低脂系2～10周齡肉雞腹部脂肪組織中均有表達(dá)(圖1)，暗示了與小鼠KLF3相似，gKLF3基因在雞脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有調(diào)控作用；在10周齡時(shí)，高脂肉雞gKLF3基因表達(dá)水平顯著高于低脂肉雞(P<0.05，圖1)，暗示gKLF3的表達(dá)水平可能是影響肉雞腹部脂肪組織沉積的一個(gè)因素。

A.Western blot檢驗(yàn)pCMV-myc-gKLF3在前脂肪細(xì)胞中的過表達(dá)效果；B.油紅O提取比色分析過表達(dá)gKLF3基因?qū)χ炯?xì)胞脂滴沉積的影響A.Western blot analysis of gKLF3 overexpression in chicken preadipocytes transfected with pCMV-myc-gKLF3 or EV；B.The lipid content of chicken preadipocytes which were transfected with pCMV-myc-gKLF3 and pCMV-myc，induced into differentiate by oleate，and absorbance was measured at 510 nm圖3 過表達(dá)gKLF3基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.3 Effects of gKLF3 gene over-expression on chicken preadipocyte differentiation

圖4 過表達(dá)gKLF3基因?qū)﹄u前脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響Fig.4 Expression analysis of differentiation marker genes in gKLF3-overexpressing chicken preadipocytes induced into differentiation by oleate

進(jìn)一步分析gKLF3基因在前脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，gKLF3基因在前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量高于成熟脂肪細(xì)胞(P<0.01，圖2A)，并且在油酸誘導(dǎo)分化的雞脂肪細(xì)胞中，gKLF3表達(dá)水平有普遍低于對(duì)照組的趨勢(shì)，暗示與哺乳動(dòng)物相似[6]，gKLF3基因在脂肪細(xì)胞分化中可能具有負(fù)調(diào)控作用。為了進(jìn)一步研究gKLF3基因?qū)﹄u脂肪細(xì)胞分化的作用，筆者在雞前脂肪細(xì)胞中過表達(dá)gKLF3基因，油紅O提取比色顯示，在油酸誘導(dǎo)后的24、72和120 h，過表達(dá)gKLF3基因的脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)脂滴形成減少的趨勢(shì)(圖3B)，進(jìn)一步暗示gKLF3基因與小鼠KLF3類似[6]，在體外具有抑制前脂肪細(xì)胞分化的作用。

C/EBPα是哺乳動(dòng)物和鳥類脂肪形成的重要調(diào)控因子[12，14-16]。C/EBPα基因敲除小鼠的研究表明，C/EBPα表達(dá)是白色脂肪組織發(fā)育的必須條件[17]。此外，C/EBPα在脂肪細(xì)胞終末分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用[18-20]。FAS基因在動(dòng)物體脂沉積中發(fā)揮了重要的作用[21]，它可以將碳水化合物合成脂肪酸，并以甘油三酯的形式儲(chǔ)存[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)gKLF3基因，在72 h會(huì)顯著抑制FAS、C/EBPα基因的表達(dá)，在24 h顯著抑制C/EBPα基因的表達(dá)(圖4，P<0.01)。筆者推斷，與哺乳動(dòng)物相似[6]，gKLF3基因可能通過抑制C/EBPα基因的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞分化。而gKLF3對(duì)FAS具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，則暗示了與線蟲KLF3[8]相似，KLF3可能具有抑制脂肪酸從頭合成和調(diào)控脂類沉積的功能。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示gKLF3和已經(jīng)報(bào)道的哺乳動(dòng)物及線蟲中KLF3相似，在肉雞脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育中至少具有2個(gè)功能，即抑制脂肪細(xì)胞分化和調(diào)控脂類合成代謝。此外，gKLF3是否直接調(diào)控C/EBPα、FAS基因的表達(dá)等具體作用機(jī)制，還有待熒光素酶活性檢測(cè)、染色質(zhì)免疫共沉淀等試驗(yàn)的進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。

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(編輯 郭云雁)

Expression Pattern of Chicken Krüppel-like Factor 3 Gene and Its Effect on Adipocyte Differentiation

WANG Hai-xia1，ZHANG Zhi-wei1，2，HE Qi1，WANG Ning1， WANG Yu-xiang1，CAO Zhi-ping1，LI Hui1*

(1.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreedingofMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductionatEducationDepartmentofHeilongjiangProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China； 2.SchoolofMedicine，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

This experiment was conducted to study the expression pattern of Krüppel-like factor 3(GallusgallusKLF3，gKLF3) gene，and its effect on adipocyte differentiation.The expression pattern ofgKLF3 in the adipose tissue and adipocytes of broilers were analyzed by using qRT-PCR.The effect ofgKLF3 on adipocyte differentiation was analyzed by over-expression technology.The result showed thatgKLF3 was consecutively expressed during the chicken adipose tissue development from 2- to 10-week-old.At 10-week-old，thegKLF3 expression in the abdominal fat tissues was significantly higher in fat line chicken than that in lean line chicken(P<0.05).Additionally，the significantly highergKLF3 expression level was observed in preadipocytes in contrast to that in mature adipocytes(P<0.01).The expression levels ofgKLF3 in preadipocytes induced by oleate were lower than that in control.Moreover，over-expression ofgKLF3 inhibited adipocyte differentiation and down-regulated expression ofFASandC/EBPα(P<0.01).The result indicate thatgKLF3 play an important role in the growth and development of chicken abdominal adipose tissue，and might restrain adipocyte differentiation by inhibiting the expression ofC/EBPαandFAS.

chicken；KLF3 gene；adipocyte differentiation；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.004

2014-05-07

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102501)；國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-42)；黑龍江省高等學(xué)校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2010td02)

王海霞(1987-)，女，山東煙臺(tái)人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：haixiawang1025@126.com

*通信作者：李 輝，教授，E-mail：lihui@neau.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)01-0026-06