副豬嗜血桿菌lgtF基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性

曾 澤，何 歡，岳 華，湯 承，張 斌

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

副豬嗜血桿菌lgtF基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性

曾 澤，何 歡，岳 華，湯 承，張 斌*

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

lgtF基因編碼的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在脂寡糖(LOS)的合成過(guò)程中負(fù)責(zé)增加一個(gè)葡萄糖合成庚糖I，在部分革蘭陰性菌中是重要的毒力相關(guān)基因，但lgtF基因在副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)中的作用還不清楚。本研究利用遺傳操作方法構(gòu)建HPS SC096的lgtF基因缺失株(ΔlgtF)。通過(guò)熱酚法分別提取缺失株與野生株的LOS，將提取的LOS進(jìn)行SDS-PAGE和銀染。比較缺失株與野生株的生長(zhǎng)曲線、抗血清中補(bǔ)體殺菌能力以及對(duì)宿主細(xì)胞——豬血管內(nèi)皮細(xì)胞(PUVEC)和豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)的黏附和入侵能力。結(jié)果表明與野生株相比，ΔlgtF的LOS糖鏈結(jié)構(gòu)變短，生長(zhǎng)速度稍微減慢，另外，ΔlgtF在兔和豬血清中抗補(bǔ)體殺菌能力明顯降低(P<0.05)，對(duì)PUVEC和PK-15細(xì)胞的黏附入侵能力明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明lgtF基因是HPS的一個(gè)毒力相關(guān)基因。

副豬嗜血桿菌；lgtF基因；缺失株；毒力相關(guān)基因

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS) 屬于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus)，能引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎為主要特征的豬革拉澤病(Gl?ser’s disease)[1-2]。HPS感染豬群會(huì)引起較高的發(fā)病率和死亡率，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。HPS分為15個(gè)血清型，而且不同血清型間毒力有明顯差異[1，3]。研究發(fā)現(xiàn)LOS參與HPS對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用，并能促進(jìn)炎性因子 IL-6 和IL-8的表達(dá)[4-5]，證實(shí)LOS參與了HPS致病過(guò)程，是一個(gè)重要的毒力因子。

LOS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，在發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[6-9]。LOS由脂質(zhì)A、2-酮-3-脫氧辛酸、庚糖和其他糖基組成[10]。單糖分析顯示HPS的LOS含有葡萄糖、半乳糖、半乳糖-N等多種成分，其中葡萄糖是主要組成成分[11]，這為L(zhǎng)OS功能的研究奠定了基礎(chǔ)。lgtF基因編碼的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)增加一個(gè)葡萄糖合成庚糖I，并參與LOS的合成[12-15]。研究表明在多數(shù)革蘭陰性菌中l(wèi)gtF基因是重要的毒力基因[13-16]。但是，lgtF基因在HPS致病過(guò)程中的作用還不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建HPS SC096的ΔlgtF缺失株，并對(duì)其LOS結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)特性、抗血清殺菌能力以及對(duì)細(xì)胞的黏附和入侵能力進(jìn)行研究，以確定lgtF基因在HPS致病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞

副豬嗜血桿菌SC096分離株、質(zhì)粒pK18mobsacB和pHV1249由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廖明教授饋贈(zèng)。質(zhì)粒pMD-19T購(gòu)自TaKaRa公司。PUVEC和PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器和試劑

恒溫金屬浴購(gòu)自博日公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermoforma公司；高速離心機(jī)5804購(gòu)自Eppendorf 公司；普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀powerpac universalTM、凝膠成像系統(tǒng)VersaDoc2000購(gòu)自Bio-Rad 公司。TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)購(gòu)自青島海博試劑有限公司；新生牛血清購(gòu)自鄭州佰安生物工程有限公司；NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，卡那霉素、氨芐霉素、紅霉素均購(gòu)自上海生工公司，pMD-19T載體、感受態(tài)DH5α，ExTaq、T4連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Gel extraction kit試劑盒，Cycle-pure kit試劑盒和Plasmid Mini kit試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI(GenBank：CP001321.1)已發(fā)布的HPS SH0165中l(wèi)gtF的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)所用引物(表 1)，各引物均由上海生物工程公司合成。引物中下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.4 缺失株的構(gòu)建

用引物P1/P2 從HPS SC096菌株的基因組中擴(kuò)增lgtF基因的上臂片段(481 bp)，用引物P3/P4 從SC096菌株的基因組中擴(kuò)增lgtF基因的下臂片段(484 bp)。以上下臂片段為模板用引物P1/P4進(jìn)行重疊序列延伸PCR，將lgtF基因上下臂連接起來(lái)，純化回收，克隆轉(zhuǎn)化到pMD19-T載體獲得質(zhì)粒pZZ001。用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ對(duì)質(zhì)粒pZZ001進(jìn)行雙酶切，純化回收，克隆轉(zhuǎn)化到pK18mobsacB并獲得質(zhì)粒pZZ002，將863 bp的紅霉素抗性片段轉(zhuǎn)入到質(zhì)粒pZZ002獲得質(zhì)粒pZZ003，用已優(yōu)化過(guò)的自然轉(zhuǎn)化方法[17]將質(zhì)粒pZZ003轉(zhuǎn)入HPS SC096株獲得lgtF基因缺失株。

表1 本研究所用的引物序列

Table 1 Sequences of primers used in this study

引物Primer引物序列(5′?3′)Sequence長(zhǎng)度/bpLengthP1(lgtF?up?HindⅢ?F)P2(lgtF?up?BamHⅠ?SalⅠ?R)CCCAAGCTTACCGCTTGTGGTAATGAAGAACAGATTACGTCGACATGCTCGGATCCTCAACTGAAGGATTCTAC481P3(lgtF?down?BamHⅠ?SalⅠ?F)P4(lgtF?down?EcoRⅠ?F)GGATCCGAGCATGTCGACAGGTTATCCTTTTTGAAATTACGGAATTCACAAGCGGTCCCTATGAATATATCACTG484P5(EmRBamHⅠ?F)P6(EmRSalⅠ?R)CGCGGATCCTTTAGTATTTTTGTAATCAGACGTGTCGACTTACTTATTAAATAATTTATA863P7(lgtF?BamHⅠ?F)P8(lgtF?R)CGCGGATCCGCGCTTGATGCGGAGCATTCAACCTTACAGCCAACGATTAGCGTC1009

下劃線部分為酶切位點(diǎn)

Restriction sites are underlined

1.5 LOS提取與SDS-PAGE

采用熱酚法[18]分別提取HPS SC096株與ΔlgtF缺失株的LOS，將提取的LOS進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠，18%分離膠)并銀染[19]分析。

1.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將HPS SC096株與ΔlgtF缺失株接種于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h左右作為種子液。再將上述種子液按培養(yǎng)基總體積的1% 接種于事先預(yù)熱到37 ℃的TSB液體培養(yǎng)基，于37 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。其間每隔1 h取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的OD600 nm值，并將結(jié)果繪制成曲線。

1.7 抗血清中補(bǔ)體殺菌試驗(yàn)

根據(jù)已描述的抗血清殺菌實(shí)驗(yàn)方法[15]，取100 μL新鮮的豬血清和兔血清或56 ℃滅活30 min的豬血清和兔血清，分別與100 μL 細(xì)菌(1×108CFU·mL-1)混合；取180 μL新鮮的豬血清和兔血清或56 ℃滅活30 min的豬血清和兔血清分別與20 μL 細(xì)菌(1×108CFU·mL-1)混合，37 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，10倍稀釋后涂布在TSA 平板(含NAD和血清)上，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。細(xì)菌存活率即為在新鮮血清中存活的細(xì)菌除以在滅活血清中的存活率。

1.8 細(xì)胞黏附入侵試驗(yàn)

為了確定細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附效果，參考文獻(xiàn)[20]方法將豬血管內(nèi)皮細(xì)胞(PUVEC)和豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)接到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO237 ℃培養(yǎng)24 h。用107CFU的菌液感染細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)2 h，用PBS清洗細(xì)胞3次，用0.1 mL 0.25%胰酶37 ℃消化細(xì)胞10 min，再加入0.9 mL TSB將細(xì)胞取出，10倍稀釋后涂布在TSA 平板(含NAD和血清)上，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。

為了確定細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的入侵效果，參考文獻(xiàn)[20]將豬血管內(nèi)皮細(xì)胞(PUVEC)和豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)接到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO237 ℃培養(yǎng)24 h。用107CFU的菌液感染細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)2 h，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入含 20 μg·mL-1的慶大霉素的DMEM 37 ℃培養(yǎng)2 h，用PBS清洗細(xì)胞3次，用0.1 mL 0.25%胰酶37 ℃消化細(xì)胞10 min，再加入0.9 mL TSB將細(xì)胞取出，10倍稀釋后涂布在TSA 平板(含NAD和血清)上，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS Statistics軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析差異顯著性，P<0.05表明差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 缺失株ΔlgtF的構(gòu)建與驗(yàn)證

用質(zhì)粒pZZ003與HPS SC096株進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，用含Em的TSA平板(含血清和NAD)進(jìn)行篩選，獲得Em抗性的接合子。用引物P5/P6和P7/P8檢測(cè)ΔlgtF缺失株(圖1A、1B)。當(dāng)用引物P5/P6分別對(duì)野生型SC096株和ΔlgtF缺失株基因組進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，電泳圖1A顯示ΔlgtF缺失株能被擴(kuò)增出一條750到1 000 bp之間條帶，與預(yù)期的863 bp的紅霉素抗性片段一致。當(dāng)用引物P7/P8分別對(duì)野生型SC096株和ΔlgtF缺失株基因組進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，電泳圖1B顯示野生型SC096株能被擴(kuò)增出一條大約1 000 bp條帶，與預(yù)期的1 009 bp的lgtF基因片段一致。從圖1C可以看出ΔlgtF缺失株是由紅霉素抗性片段取代野生型SC096株中l(wèi)gtF基因目的片段而成。

2.2 野生株與缺失株ΔlgtF的LOS結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)特性的比較

為了比較HPS SC096株與ΔlgtF缺失株LOS的不同，將提取的野生株和ΔlgtF的LOS經(jīng)SDS-PAGE并銀染后得到圖2A。銀染圖顯示ΔlgtF缺失株的LOS泳動(dòng)明顯快于野生株LOS，這表明ΔlgtF缺失株LOS的相對(duì)分子質(zhì)量有所減小，LOS的糖鏈結(jié)構(gòu)有所縮短，即表明HPS SC096缺失掉lgtF基因后LOS的糖鏈結(jié)構(gòu)縮短。HPS SC096株與ΔlgtF缺失株的生長(zhǎng)曲線圖(圖2B)顯示ΔlgtF缺失株的生長(zhǎng)速度略低于野生株的生長(zhǎng)速度。

2.3 野生株與ΔlgtF缺失株抗血清殺菌能力比較

為了研究HPS的lgtF基因是否參與了抗血清殺菌的作用，對(duì)野生型SC096株和ΔlgtF缺失株的抗血清殺菌能力進(jìn)行了比較。結(jié)果表明在50%和90%的血清中，野生型SC096株具有高水平的抵抗血清殺菌能力(圖3)。在50%和90%血清中，與野生型SC096株相比ΔlgtF缺失株細(xì)菌存活率大約降低了1.5和2倍(P<0.05)。這表明HPS SC096缺失掉lgtF基因后抗血清殺菌能力明顯降低。

A.引物P5/P6鑒定；B.引物P7/P8鑒定； C.ΔlgtF缺失株和野生型SC096株模式圖；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.野生型SC096株；2.ΔlgtF缺失株；3.陰性對(duì)照A.Identification by primer P5 and P6；B.Identification by primer P7 and P8；C.Characterization and construction of ΔlgtF mutant and wild-type SC096；M.DL2000 DNA marker；1.Wild-type SC096；2.ΔlgtF mutant；3.Negative control圖1 ΔlgtF缺失株的鑒定Fig.1 Identification of ΔlgtF mutant strain

A.LOS的銀染圖；1.野生型SC096；2.ΔlgtF缺失株；B.生長(zhǎng)曲線，誤差線代表三次重復(fù)試驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)誤A.LOS profiles；1.Wild-type SC096 strain；2.ΔlgtF mutant；B.Growth curve，error bars represent the standard deviation from three independent experiments圖2 野生株與ΔlgtF缺失株的LOS SDS-PAGE銀染圖及生長(zhǎng)曲線Fig.2 LOS profiles and growth curve of wild-type SC096 strain and ΔlgtF mutant

A.50%豬和兔血清；B.90%豬和兔血清；*.與野生型SC096株相比差異顯著(P<0.05)，誤差線代表三次重復(fù)試驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)誤A.50% porcine and rabbit sera；B.90% porcine and rabbit sera；*.Significant difference (P<0.05) between strains.Error bars represent the standard deviation from three independent experiments圖3 野生型SC096株和ΔlgtF缺失株在豬和兔血清中抗血清殺菌作用Fig.3 Survival of wild-type SC096 strain and the ΔlgtF mutant in porcine and rabbit sera

2.4 野生株與ΔlgtF缺失株對(duì)細(xì)胞黏附入侵能力比較

為了研究lgtF基因在HPS對(duì)細(xì)胞黏附入侵中發(fā)揮的作用，對(duì)ΔlgtF缺失株和野生型SC096株的黏附、入侵水平進(jìn)行了比較(圖4)。發(fā)現(xiàn)ΔlgtF缺失株對(duì)PK-15 和 PUVEC細(xì)胞的黏附水平明顯的降低(P<0.05)，相對(duì)于野生型SC096株，ΔlgtF缺失株的黏附量降低2倍。而且，ΔlgtF缺失株對(duì)PK-15 和 PUVEC細(xì)胞的入侵量也表現(xiàn)出明顯的降低(P<0.05)，相對(duì)于野生型SC096株，ΔlgtF缺失株的入侵水平大約降低2倍。這表明HPS SC096缺失掉lgtF基因后對(duì)細(xì)胞的黏附入侵能力明顯降低。

*.與野生型SC096株相比差異顯著(P<0.05)，誤差線代表三次重復(fù)試驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)誤*.Significant difference (P<0.05) between strains.Error bars represent the standard deviation from three independent experiments圖4 野生型SC096株和ΔlgtF缺失株對(duì)PK-15和PUVEC細(xì)胞的黏附和入侵Fig.4 Adherence(A) and invasion(B) of H.parasuis wild-type SC096 and ΔlgtF mutant in PK-15 and PUVEC cells

3 討 論

LOS除了可以保持外膜的穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境的壓力之外，通常作為內(nèi)毒素、黏附因子、宿主防御因子等參與多數(shù)革蘭陰性菌的致病機(jī)制[21-23]。在HPS中，LOS已經(jīng)被證實(shí)為重要的毒力因子[4-5，11，24]。為了進(jìn)一步研究LOS成分與HPS發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系，本研究從HPS SC096基因組中敲除lgtF基因獲得ΔlgtF缺失株。而且該ΔlgtF缺失株的LOS糖鏈結(jié)構(gòu)明顯變短，這表明在HPS中l(wèi)gtF基因參與LOS的合成，這與之前的相關(guān)研究結(jié)果一致[13-15，25]。在HPS中，庚糖I已被證實(shí)參與LOS的合成[24]。推測(cè)由于缺失掉lgtF基因之后，菌體內(nèi)缺乏葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶從而影響庚糖I的合成，最終導(dǎo)致LOS糖鏈結(jié)構(gòu)的變短。ΔlgtF缺失株的生長(zhǎng)速度略低于野生株的生長(zhǎng)速度，這表明lgtF基因參與HPS SC096的生長(zhǎng)代謝，這可能是由于HPS SC096敲除掉lgtF基因后外膜不穩(wěn)定而影響了菌株的生長(zhǎng)代謝。

抗血清殺菌作用是病原菌一種重要的毒力機(jī)制[26]。引起全身性感染的HPS具有抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌作用，這個(gè)特性有助于細(xì)菌突破機(jī)體的防御系統(tǒng)而在血液中存活。在HPS 中，缺失掉rfaE、CDT、rfaF和opsX基因后都會(huì)使菌株的抗血清殺菌能力明顯地降低，表明rfaE、CDT、rfaF和opsX基因參與HPS的抗血清殺菌作用[20，24，27]。在流感嗜血桿菌和空腸彎曲桿菌中，缺失lgtF基因都會(huì)使菌株的抗血清殺菌能力明顯降低[13，15]。在本研究中，ΔlgtF缺失株的抗血清殺菌能力與野生株相比明顯降低，推測(cè)可能是由于LOS結(jié)構(gòu)的不完整性影響了菌株抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌作用。這表明在HPS SC096的抗血清殺菌作用中l(wèi)gtF基因起著重要的作用，因此可以推測(cè)lgtF基因在HPS SC096的毒力中扮演著重要的角色，可能是一個(gè)毒力相關(guān)基因。

對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵是病原體發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵步驟。在HPS 中，缺失掉rfaE、CDT、rfaD、rfaF和opsX基因后都會(huì)顯著降低菌株對(duì)細(xì)胞的黏附能力，這表明在HPS中rfaE、CDT、rfaD、rfaF和opsX都是重要的黏附因子[20，24，27-28]。在流感嗜血桿菌和空腸彎曲桿菌中，ΔlgtF缺失株在體內(nèi)的定植能力和增殖能力都明顯下降[13，29]。在本研究中，缺失lgtF基因之后菌株對(duì)PK-15和PUVEC細(xì)胞的黏附和入侵能力都明顯降低，這可能是由于ΔlgtF缺失株的LOS結(jié)構(gòu)不完整導(dǎo)致菌株的外膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定引起的。這表明lgtF基因在HPS SC096對(duì)PK-15和PUVEC細(xì)胞的黏附和入侵過(guò)程中起重要作用，因此可以推測(cè)lgtF基因可能是HPS的黏附因子，但也可能是導(dǎo)致了其他黏附因子功能的下降或喪失。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建HPS SC096的ΔlgtF缺失株。ΔlgtF缺失株的LOS糖鏈結(jié)構(gòu)明顯變短，生長(zhǎng)速度稍微減慢；ΔlgtF缺失株的抗血清殺菌能力以及對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵能力都明顯降低。以上結(jié)果表明在HPS SC096致病過(guò)程中l(wèi)gtF基因可能是一個(gè)重要的毒力相關(guān)基因。

[1] CAI X，CHEN H，BLACKALL P J，et al.Serological characterization ofHaemophilusparasuisisolates from China[J].VetMicrobiol，2005，111(3-4)：231-236.

[2] OLIVEIRA S，PIJOAN C.Haemophilusparasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control[J].VetMicrobiol，2004，99(1)：1-12.

[3] KIELSTEIN P，RAPP-GABRIELSON V J.Designation of 15 serovars ofHaemophilusparasuison the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts[J].JClinMicrobiol，1992，30(4)：862-865.

[4] BOUCHET B，VANIER G，JACQUES M，et al.Interactions ofHaemophilusparasuisand its LOS with porcine brain microvascular endothelial cells[J].VetRes，2008，39(5)：42.

[5] BOUCHET B，VANIER G，JACQUES M，et al.Studies on the interactions ofHaemophilusparasuiswith porcine epithelial tracheal cells：limited role of LOS in apoptosis and pro-inflammatory cytokine release[J].MicrobPathog，2009，46(2)：108-113.

[6] SWORDS W E，BUSCHER B A，VER STEEG II K，et al.Non-typeableHaemophilusinfluenzaeadhere to and invade human bronchial epithelial cells via an interaction of lipooligosaccharide with the PAF receptor[J].MolMicrobiol，2000，37(1)：13-27.

[7] KANIPES M I，HOLDER L C，CORCORAN A T，et al.A deep-rough mutant ofCampylobacterjejuni81-176 is noninvasive for intestinal epithelial cells[J].InfectImmun，2004，72(4)：2452-2455.

[8] ERWIN A L，ALLEN S，HO D K，et al.Role of lgtC in resistance of nontypeableHaemophilusinfluenzaestrain R2866 to human serum[J].InfectImmun，2006，74(11)：6226-6235.

[9] HO D K，RAM S，NELSON K L，et al.IgtC expression modulates resistance to C4b deposition on an invasive nontypeableHaemophilusinfluenzae[J].JImmunol，2007，178(2)：1002-1012.

[10] GOLEC M.Cathelicidin LL-37：LPS-neutralizing，pleiotropic peptide[J].AnnAgricEnvironMed，2007，14(1)：1-4.

[11] PERRY M B，MACLEAN L L，GOTTSCHALK M，et al.Structure of the capsular polysaccharides and lipopolysaccharides fromHaemophilusparasuisstrains ER-6P(serovar 15) and Nagasaki(serovar 5)[J].CarbohydrRes，2013，378：91-97.

[12] HOOD D W，COX A D，WAKARCHUK W W，et al.Genetic basis for expression of the major globotetraose-containing lipopolysaccharide fromH.influenzaestrain Rd(RM118)[J].Glycobiology，2001，11(11)：957-967.

[13] HOOD D W，DEADMAN M E，COX A D，et al.Three genes，lgtF，lic2C and lpsA，have a primary role in determining the pattern of oligosaccharide extension from the inner core ofHaemophilusinfluenzaeLPS[J].Microbiology，2004，150(Pt7)：2089-2097.

[14] FILIATRAULT M J，GIBSON B W，SCHILLING B，et al.Construction and characterization ofHaemophilusducreyilipooligosaccharide(LOS) mutants defective in expression of heptosyltransferase III and β-1，4-glucosyltransferase：identification of LOS glycoforms containing lactosamine repeats[J].InfectImmun，2000，68(6)：3352-3361.

[15] NAITO M，F(xiàn)RIRDICH E，F(xiàn)IELDS J A，et al.Effect of sequentialCampylobacterjejuni81-176 lipooligosaccharide core truncations on biofilm formation，stress survival，and pathogenesis[J].JBacteriol，2010，192(8)：2182-2192.

[16] KANIPES M I，TAN X，AKELAITIS A，et al.Genetic analysis of lipooligosaccharide core biosynthesis inCampylobacterjejuni81-176[J].JBacteriol，2008，190(5)：1568-1574.

[17] ZHANG B，F(xiàn)ENG S，XU C，et al.Serum resistance inHaemophilusparasuisSC096 strain requires outer membrane protein P2 expression[J].FEMSMicrobiolLett，2012，326(2)：109-115.

[18] HITCHCOCK P J，BROWN T M.Morphological heterogeneity amongSalmonellalipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels[J].JBacteriol，1983，154(1)：269-277.

[19] TSAI C M，F(xiàn)RASCH C E.A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels[J].AnalBiochem，1982，119(1)：115-119.

[20] ZHANG B，HE Y，XU C，et al.Cytolethal distending toxin(CDT) of theHaemophilusparasuisSC096 strain contributes to serum resistance and adherence to and invasion of PK-15 and PUVEC cells[J].VetMicrobiol，2012，157(1-2)：237-242.

[21] FRIRDICH E，WHITFIELD C.Lipopolysaccharide inner core oligosaccharide structure and outer membrane stability in human pathogens belonging to the Enterobacteriaceae[J].JEndotoxinRes，2005，11(3)：133-144.

[22] PLANT L，SUNDQVIST J，ZUGHAIER S，et al.Lipooligosaccharide structure contributes to multiple steps in the virulence ofNeisseriameningitidis[J].InfectImmun，2006，74(2)：1360-1367.

[23] ZARANTONELLI M L，HUERRE M，TAHA M K，et al.Differential role of lipooligosaccharide ofNeisseriameningitidisin virulence and inflammatory response during respiratory infection in mice[J].InfectImmun，2006，74(10)：5506-5512.

[24] XU C，ZHANG L，ZHANG B，et al.Involvement of lipooligosaccharide heptose residues ofHaemophilusparasuisSC096 strain in serum resistance，adhesion and invasion[J].VetJ，2013，195(2)：200-204.

[25] KAHLER C M，CARLSON R W，RAHMAN M M，et al.Two glycosyltransferase genes，lgtF and rfaK，constitute the lipooligosaccharide ice(inner core extension) biosynthesis operon ofNeisseriameningitidis[J].JBacteriol，1996，178(23)：6677-6684.

[27] ZHANG B，YU Y，ZENG Z，et al.Deletion of therfaEgene inHaemophilusparasuisSC096 strain attenuates serum resistance，adhesion and invasion[J].MicrobPathog，2014，74：33-37.

[28] ZHANG B，XU C，ZHANG L，et al.Enhanced adherence to and invasion of PUVEC and PK-15 cells due to the overexpression of RfaD，ThyA and Mip in the ΔompP2 mutant ofHaemophilusparasuisSC096 strain[J].VetMicrobiol，2013，162(2-4)：713-723.

[29] MOREY P，VIADAS C，EUBA B，et al.Relative contributions of lipooligosaccharide inner and outer core modifications to nontypableHaemophilusinfluenzaepathogenesis[J].InfectImmun， 2013，81(11)：4100-4111.

(編輯 白永平)

Construction and Characterization of aHaemophilusparasuisSC096 ΔlgtFMutant Strain

ZENG Ze，HE Huan，YUE Hua，TANG Cheng，ZHANG Bin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

ThelgtFencodes a glucosyltransferase responsible for adding a glucose to get heptose I in the synthesis of Lipooligosaccharide (LOS).ThelgtFgene is an important virulence-associated gene in some Gram-negative bacteria.However，the function oflgtFgene inHaemophilusparasuiswas still unknown.We constructed an ΔlgtFmutant (ΔlgtF) ofH.parasuisSC096 using a natural transformation system.The LOS ofH.parasuisSC096 strain，ΔlgtFmutant was extracted by the hot phenol-water method.The LOS was addressed by SDS-PAGE and sliver stain.The growth curve，Serum resistance activity，adhesion and invasion ability in porcine kidney epithelial cells (PK-15) and porcine umbilical vein endothelial cells (PUVEC) of wild type SC096 and ΔlgtFmutant were measured.Compared to the wild-type SC096 strain，the ΔlgtFmutant exhibited obvious truncation of LOS structure and slight growth defect.Furthermore，the mutant had a greater sensitivity to the bactericidal action of porcine and rabbit serum (P<0.05)，and displayed a significantly reduced ability to adhere to and invade PK-15 and PUVEC (P<0.05).The above findings suggested that thelgtFgene is a virulence-associated gene of theH.parasuisSC096 strain.

Haemophilusparasuis；lgtFgene；mutant；virulence-associated gene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.019

2015-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31302119)；四川省教育廳項(xiàng)目(14ZB046)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303034-1)；西南民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014NZYQN42)

曾 澤(1991-)，女，貴州畢節(jié)人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)，E-mail:839017291@qq.com

*通信作者：張 斌，副研究員，E-mail：binovy@sina.com

S852.613

A

0366-6964(2015)11-2056-07