豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1α(nsp1α)的N端鋅指結(jié)構(gòu)是其抑制NLRP3炎癥小體活性所必需

王 超，史西保，王 麗，陳 靜，司朝朝，王愛萍，鄧瑞廣，張改平1，，3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；4.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；5.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；6.鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1α(nsp1α)的N端鋅指結(jié)構(gòu)是其抑制NLRP3炎癥小體活性所必需

王 超1，2，5，史西保2，4，王 麗2，陳 靜2，司朝朝2，王愛萍6，鄧瑞廣2，張改平1，2，3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；4.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；5.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；6.鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450000)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病之一，其致病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特異性免疫反應(yīng)，引起機(jī)體免疫抑制，造成持續(xù)性感染，從而給該病的防控帶來(lái)困難。NLRP3炎癥小體作為先天性免疫的重要組分在機(jī)體抗病毒中發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)PRRSV能夠激活NLRP3炎癥小體，但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎癥小體的組分還未見報(bào)道。本研究首先在缺失內(nèi)源性炎癥小體的HEK293T細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，建立NLRP3炎癥小體的體外研究模型。然后，在該炎癥小體模型細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PRRSV nsp1α的真核表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果表明nsp1α能夠明顯拮抗炎癥小體的活化，而進(jìn)一步的突變?cè)囼?yàn)表明缺失N端鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)或者突變ZF結(jié)構(gòu)的nsp1α均不能抑制NLRP3炎癥小體活化。本研究不僅首次發(fā)現(xiàn)了拮抗NLRP3炎癥小體活化的PRRSV蛋白——nsp1α，而且發(fā)現(xiàn)nsp1α 的N端鋅指結(jié)構(gòu)是其抑制NLRP3炎癥小體活性所必需。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了PRRSV拮抗天然免疫的新機(jī)制，并為PRRSV的防控提供了潛在的分子靶點(diǎn)和理論指導(dǎo)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；nsp1α；ZF結(jié)構(gòu)域；NLRP3炎癥小體；IL-1β

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)為有嚢膜的單股正鏈RNA病毒，與馬動(dòng)脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)、小鼠乳酸脫氫酶病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和猴出血熱病毒(simian hemorrhagic fever virus，SHFV)同屬尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科[1]。1991年歐洲首先分離到PRRSV，隨后美國(guó)、加拿大及中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)也相繼分離到該病毒，PRRSV抑制宿主的天然免疫和特異性免疫反應(yīng)，引起機(jī)體免疫抑制，從而給控制該病帶來(lái)了困難，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

越來(lái)越多的研究表明NLRP3炎癥小體作為先天性免疫的重要組分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。NLRP3炎癥小體是最近研究較廣泛的炎癥小體，是由支架蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)分子procaspase-1相互結(jié)合而形成，主要介導(dǎo)procaspase-1的活化和促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的分泌。在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中，由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β的表達(dá)和分泌至少需要兩個(gè)信號(hào)刺激，一是如內(nèi)毒素(LPS)等病原相關(guān)分子模式被細(xì)胞模式識(shí)別受體識(shí)別，從而使機(jī)體上調(diào)表達(dá)IL-1β的前體mRNA，另一信號(hào)是如ATP和Nigericin等引起NLRP3招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18[3-4]。

前期報(bào)道流感病毒(influenza A virus，IAV)、腺病毒(adenovirus)、仙臺(tái)病毒(Sendai virus，Sev)以及PRRSV等都可以激活NLRP3炎癥小體[5-8]，而IAV的缺陷小鼠試驗(yàn)表明，NLRP3、ASC和Caspase-1缺陷的小鼠在IAV感染中其呼吸道炎癥明顯削弱且死亡率顯著提高[5，7，9-10]，提示NLRP3炎癥小體可能在抗病毒感染中起重要作用，而相應(yīng)的，病毒也表達(dá)抑制NLRP3炎癥小體的組分從而拮抗NLRP3先天性免疫[11-12]，因此篩選抑制NLRP3炎癥小體的病毒組分將會(huì)為進(jìn)一步的抗病毒治療提供潛在分子靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。因此，作者擬以PRRSV為研究對(duì)象，篩選可能抑制NLRP3炎癥小體活化的病毒組分，為進(jìn)一步探討NLRP3炎癥小體在PRRSV免疫學(xué)中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株和菌株

PRRSV美洲型經(jīng)典毒株BJ-4株(GenBank：AF331831)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存；MARC-145細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

DMEM、PRMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol試劑購(gòu)自Life Technologies公司；DNA回收試劑盒以及質(zhì)粒抽提和純化試劑盒購(gòu)自AxyGen公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen公司；LPS(O55：B5)購(gòu)自Sigma公司；Nigericin購(gòu)自InvivoGen公司；豬IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D Systems公司。

1.3 質(zhì)粒

pcDNA3.1-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α及其突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α DZF、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α ZF、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C8A、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C10A、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C25A和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α C28A均由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[13]。用LPS刺激PAMs，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別用NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的特異性引物進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FLAG中，得到pcDNA3.1-FLAG-NLRP3、pcDNA3.1-FLAG-ASC、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1和pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β。并由生工生物工程公司測(cè)序確證。PCR引物如下(表1)。

表 1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所使用的引物及其序列

Table 1 Primers used in plasmid construction

引物Primers引物序列(5′?3′)SequencesNLRP3ForGATATCCATGAGCATGGCAAGCGTCCGCTNLRP3RevCTCGAGCTACTGGGAAGGCTCAAAGACAATprocaspase?1ForGGTACCCATGGCCGATAAGGTGCTGAAGGAprocaspase?1RevCTCGAGTTAATGTCCTGGGAAGAGATAApro?IL?1βForAAGCTTCATGGCCATAGTACCTGAACCCGCpro?IL?1βRevCTCGAGTTAGGGAGAGAGGACTTCCATGGTASCForAAGCTTCATGGGGTGCACGCGTGACGCCATASCRevCTCGAGTCAGCTCTGCTCCAGGTCGGCCACpro?IL?1βRTForCTTGAAGAGAGAAGTGGTGTTCTGpro?IL?1βRTRevATCACACAAGACAGGTACAGATTCT

1.4 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)的制備

挑選6周齡左右，健康且PRRSV抗原抗體雙陰性豬。臂動(dòng)脈叢放血致死，剖開胸腔，將氣管上下兩端結(jié)扎后，取出肺，用無(wú)菌PBS充分漂洗肺表面，然后，沿氣管內(nèi)壁注入約100 mL含雙抗的無(wú)菌PBS緩沖液，輕輕拍打肺表面1～2 min，回收灌洗液，重復(fù)該步驟2～3次，直至灌洗液變清亮為止；將灌洗液用移液管輕輕吹打并用單層無(wú)菌濾網(wǎng)過濾，將收集到的灌洗液按照1 000 r·min-1離心8 min，用20 mL PBS重懸沉淀，重復(fù)2次，棄上清；用含雙抗的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106·mL-1，接種到24孔培養(yǎng)板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，棄上清，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 炎癥小體模型重構(gòu)

將HEK293T細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)至細(xì)胞濃度3.5×105·mL-1，按每孔500 μL鋪于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLAG-NLRP3(150 ng)、pcDNA3.1-FLAG-ASC(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β(300 ng)和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(600 ng)或pcDNA3.1-FLAG-nsp1α(600 ng)及其突變體至HEK293T細(xì)胞，具體操作嚴(yán)格按Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。24 h后收集細(xì)胞上清液并用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量。

1.6 PAMs的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

參照Lipofectamine 2000說明書，將pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α按照800 ng·孔-1，每組三個(gè)重復(fù)，對(duì)24孔板中新鮮制備的PAMs進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，6 h后換液并用LPS(1 μg·mL-1)進(jìn)行刺激，48 h后TRIzol裂解細(xì)胞，并用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-1β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

參照Lipofectamine 2000說明書，將pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α按照800 ng·孔-1，每組三個(gè)重復(fù)，對(duì)24孔板中新鮮制備的PAMs進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，6 h后換液并用LPS(1 μg·mL-1)進(jìn)行刺激，24 h后再加入Nigericin(10 μmol·L-1)共同刺激，48 h后收集細(xì)胞上清液并用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β蛋白的表達(dá)水平。

1.7 RNA提取及Real-Time PCR

TRIzol試劑裂解PAMs，根據(jù)說明書提取總RNA，取1 μg RNA，按照PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；然后以此cDNA為模板根據(jù)SYBR Green real-time PCR Master Mix說明書進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)檢測(cè)IL-1β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析，GAPDH為內(nèi)參。所用跨內(nèi)含子引物見表1。

1.8 IL-1β蛋白水平檢測(cè)

細(xì)胞上清液中IL-1β分泌水平的檢測(cè)采用商業(yè)化的豬IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.9 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用T檢驗(yàn)法或單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異，用“*”表示。本文所有圖表均使用GraphPad Prism 6.0軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

通過RT-PCR的方法從LPS刺激過的PAMs中克隆出NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β基因的編碼區(qū)序列，酶切后將其連接至pcDNA3.1-FLAG載體中，測(cè)序確證得到NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG-NLRP3、pcDNA3.1-FLAG-ASC、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1和pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β。

2.2 NLRP3炎癥小體模型重構(gòu)

將pcDNA3.1-FLAG-NLRP3(150 ng)、pcDNA3.1-FLAG-ASC(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1(50 ng)、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β(300 ng)和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(600 ng)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖1)，在共轉(zhuǎn)染這四個(gè)炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒時(shí)，可以引起IL-1β的表達(dá)且表達(dá)量最高，而陰性對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β)的IL-1β的表達(dá)量則較低。結(jié)果表明在HEK293T細(xì)胞上成功重構(gòu)了NLRP3炎癥小體模型。

HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測(cè)IL-1β蛋白表達(dá)HEK293T cells were transfected with expression plasmids encoding NLRP3，ASC，procaspase-1，and pro-IL-1β or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β expression was analysed by ELISA圖1 HEK293T細(xì)胞上重構(gòu)NLRP3炎癥小體Fig.1 Reconstruct NLRP3 inflammasome in HEK293T cells

2.3 PRRSV nsp1α抑制由NLRP3介導(dǎo)的炎癥小體活化

PRRSV至少編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural proteins，nsps)，這些nsps主要參與病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[14]。而研究表明PRRSV nsp1α是PRRSV的重要免疫抑制蛋白，具有抑制IFN-β轉(zhuǎn)錄和TNF-α的產(chǎn)生等作用[13，15-16]。因此，本試驗(yàn)將探究nsp1α是否抑制NLRP3炎癥小體活化。將NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四個(gè)炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α(600 ng)或者對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(600 ng)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖2A)，共轉(zhuǎn)染nsp1α后，IL-1β的表達(dá)與共轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組相比，下降約50%，具有顯著性差異(P<0.05)。

另外，將nsp1α或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染PAMs并用LPS或LPS和Nigericin刺激后，qRT-PCR結(jié)果顯示(圖2B)，IL-1β的mRNA水平與對(duì)照質(zhì)粒組相比，下降約60%，具有顯著性差異(P<0.05)；ELISA結(jié)果顯示(圖2C)，IL-1β蛋白水平的表達(dá)與對(duì)照質(zhì)粒組相比，下降約24%，具有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，PRRSV nsp1α可以抑制由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β的表達(dá)。

A.HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染NLRP3炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒和nsp1α或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測(cè)IL-1β表達(dá)；B.PAMs轉(zhuǎn)染nsp1α或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG，LPS刺激后，qRT-PCR 檢測(cè)IL-1β mRNA表達(dá)；C.PAMs轉(zhuǎn)染nsp1α或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA檢測(cè)IL-1β蛋白表達(dá)。*.P<0.05A.HEK293T cells were transfected with NLRP3 inflammasome and nsp1α or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β secretion was analyzed by ELISA；B.PAMs were transfected with nsp1α or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS，IL-1β mRNA was quantified by qRT-PCR；C.PAMs were transfected with nsp1α or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS plus Nigericin，IL-1β secretion was analyzed by ELISA.*.P<0.05圖2 PRRSV nsp1α可以抑制NLRP3炎癥小體活化介導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生Fig.2 PRRSV nsp1α can inhibit NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β production

2.4 nsp1α的N端ZF結(jié)構(gòu)是其抑制NLRP3炎癥小體活化所必需的

nsp1α包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：分別是N端的鋅指結(jié)構(gòu)功能域(zinc-finger domain，ZF，Met1-Glu65)、中間的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶區(qū)域(papain-like cysteine protease，PCPα，Pro66-Gln166)和C端的延長(zhǎng)區(qū)域(C terminal extension，CTE，Arg167-Met180)[17]。為研究nsp1α的ZF結(jié)構(gòu)域是否在nsp1α抑制IL-1β的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，將缺失ZF結(jié)構(gòu)域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α DZF或者只含有ZF結(jié)構(gòu)域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α ZF與炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖3A)，轉(zhuǎn)染缺失ZF結(jié)構(gòu)域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α DZF后，IL-1β的表達(dá)量與對(duì)照質(zhì)粒組相比無(wú)顯著性差異，表明缺失ZF結(jié)構(gòu)域后nsp1α不能夠抑制IL-1β的表達(dá)。另外，轉(zhuǎn)染只含有ZF結(jié)構(gòu)域的突變體pcDNA3.1-FLAG-nsp1α ZF后，IL-1β的表達(dá)量與對(duì)照質(zhì)粒組相比無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果表明ZF結(jié)構(gòu)域在nsp1α抑制IL-1β表達(dá)中起著不可或缺的作用。

在ZF結(jié)構(gòu)域中，圍繞著Zn離子周圍與Zn離子結(jié)合的有四個(gè)半胱氨酸殘基(Cys8、Cys10、Cys25和Cys28)，而突變?nèi)魏我粋€(gè)半胱氨酸殘基都會(huì)破壞ZF結(jié)構(gòu)[15]。因此，將這四個(gè)單氨基酸突變體nsp1α C8A、nsp1α C10A、 nsp1α C25A、nsp1α C28A分別與炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖3B)，轉(zhuǎn)染四個(gè)突變體后，IL-1β的表達(dá)與對(duì)照質(zhì)粒組無(wú)顯著性差異，表明突變?nèi)魏我粋€(gè)半胱氨酸殘基后，nsp1α都不能夠抑制IL-1β的表達(dá)。

2.5 PRRSV nsp1α ZF結(jié)構(gòu)域突變體轉(zhuǎn)染PAMs

按照Lipofectamine 2000說明書，將pcDNA3.1-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α及其ZF結(jié)構(gòu)域突變體轉(zhuǎn)染PAMs，在LPS和Nigericin的共同刺激下，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清液，ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖4)，轉(zhuǎn)染nsp1α后，IL-1β的表達(dá)與對(duì)照組相比，下降約30%，具有顯著性差異(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染nsp1α能夠抑制IL-1β的表達(dá)。而轉(zhuǎn)染PRRSV nsp1α ZF結(jié)構(gòu)域的突變體后，與對(duì)照組相比，IL-1β的表達(dá)并無(wú)顯著性差異，均不能夠抑制IL-1β的表達(dá)。上述結(jié)果表明，在PAMs上，PRRSV nsp1α可以抑制由LPS和Nigericin引起的IL-1β的表達(dá)，并且ZF結(jié)構(gòu)域在nsp1α抑制IL-1β表達(dá)的過程中是必需的。

A.HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染NLRP3炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒和nsp1α或缺失ZF結(jié)構(gòu)域突變體nsp1α DZF或只含有ZF結(jié)構(gòu)域突變體nsp1α ZF或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測(cè)IL-1β表達(dá)；B.HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染NLRP3炎癥小體相關(guān)質(zhì)粒和nsp1α或四個(gè)單氨基酸突變體nsp1α C8A、nsp1α C10A、nsp1α C25A、nsp1α C28A或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG(-)，ELISA檢測(cè)IL-1β表達(dá)。*.P<0.05A.HEK293T cells were transfected with NLRP3 inflammasome and nsp1α or nsp1α DZF or nsp1α ZF or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β secretion was analyzed by ELISA；B.HEK293T cells were transfected with NLRP3 inflammasome and nsp1α or nsp1α C8A，nsp1α C10A，nsp1α C25A，nsp1α C28A or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-)，IL-1β secretion was analyzed by ELISA.*.P<0.05圖3 HEK293T細(xì)胞上ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The ELISA result in HEK293T cells

A.PAMs轉(zhuǎn)染nsp1α或缺失ZF結(jié)構(gòu)域突變體nsp1α DZF或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA檢測(cè)IL-1β表達(dá)；B.PAMs轉(zhuǎn)染nsp1α或四個(gè)單氨基酸突變體nsp1α C8A、nsp1α C10A、 nsp1α C25A、nsp1α C28A或只含有ZF結(jié)構(gòu)域突變體nsp1α ZF或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA檢測(cè)IL-1β表達(dá)。*.P<0.05A.PAMs were transfected with nsp1α or nsp1α DZF or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS plus Nigericin，IL-1β secretion was analyzed by ELISA；B.PAMs were transfected with nsp1α or nsp1α C8A，nsp1α C10A，nsp1α C25A，nsp1α C28A or control plasmid pcDNA3.1-FLAG(-) and then were stimulated with LPS plus Nigericin，IL-1β secretion was analyzed by ELISA.*.P<0.05圖4 PAMs上ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The ELISA result in PAMs

3 討 論

PRRS是影響世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)最為嚴(yán)重的疾病之一，每年給全世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV在感染豬體內(nèi)主要侵害豬的巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，特別是肺泡巨噬細(xì)胞，使受感染豬的免疫力降低，引發(fā)免疫抑制，造成持續(xù)性感染，從而給該病的預(yù)防和控制帶來(lái)了困難。越來(lái)越多的研究證明了NLRP3炎癥小體在宿主抗病毒感染中的重要作用。本研究首先利用HEK293T細(xì)胞缺失內(nèi)源性炎癥小體的特點(diǎn)，通過共轉(zhuǎn)染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，在HEK293T細(xì)胞上建立了NLRP3炎癥小體的體外研究模型[12，18-19](圖1)。然后，利用該炎癥小體活化模型首次發(fā)現(xiàn)了拮抗炎癥小體活化的PRRSV蛋白-nsp1α(圖2A)。

IL-1β是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，在宿主的先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。IL-1β的活性在其表達(dá)、成熟和分泌的過程中被嚴(yán)格調(diào)控，并且需要至少兩個(gè)信號(hào)的共同作用：第一信號(hào)是由促炎性刺激物如LPS引起的IL-1β前體(pro-IL-1β)的生成；第二信號(hào)是由如ATP和Nigericin等刺激引起的procaspase-1的活化，活化的caspase-1剪切pro-IL-1β，使其成熟并且釋放到細(xì)胞外。而圖2B和圖2C的結(jié)果不僅確證了圖2A 的結(jié)果，而且也暗示nsp1α不僅抑制炎癥小體活化的第一信號(hào)途徑，而且也抑制炎癥小體的第二信號(hào)途徑。

前期研究表明N端鋅指結(jié)構(gòu)(C8-C10-C25-C28)在nsp1α抑制IFN-β中發(fā)揮著重要作用[13]，而本試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ZF結(jié)構(gòu)域在nsp1α抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β的表達(dá)和分泌中發(fā)揮著不可或缺的作用(圖3和圖4)，這些試驗(yàn)結(jié)果表明nsp1α的N端鋅指結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮免疫抑制功能的重要結(jié)構(gòu)域。

綜上所述，PRRSV感染激活NLRP3炎癥小體并產(chǎn)生IL-1β等促炎性細(xì)胞因子來(lái)抵御病毒入侵和保護(hù)機(jī)體的同時(shí)，病毒自身又編碼能拮抗NLRP3炎性小體活化的蛋白——nsp1α，使自身能夠在宿主體內(nèi)增殖。因此，本研究不僅進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了PRRSV拮抗天然免疫的新機(jī)制——拮抗NLRP3炎性小體活化，而且也為PRRSV的防控提供了潛在的分子靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

在HEK293T細(xì)胞上成功重構(gòu)NLRP3炎癥小體，利用這一模型以及LPS和Nigericin共刺激PAMs的模型，經(jīng)過突變體轉(zhuǎn)染試驗(yàn)共同證實(shí)了ZF結(jié)構(gòu)在PRRSV nsp1α抑制由NLRP3炎癥小體信號(hào)通路介導(dǎo)的IL-1β表達(dá)的過程中是必需的。

[1] MEULENBERG J J，HULST M M，DE MEIJER E J，et al.Lelystad virus，the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome(PEARS)，is related to LDV and EAV[J].Virology，1993，192(1)：62-72.

[2] NEUMANN E J，KLIEBENSTEIN J B，JOHNSON C D，et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J].JAmVetMedAssoc，2005，227(3)：385-392.

[3] ATIANAND M K，RATHINAM V A，F(xiàn)ITZGERALD K A.SnapShot：inflammasomes[J].Cell，2013，153(1)：272-272.e1.

[4] SCHRODER K，TSCHOPP J.The inflammasomes[J].Cell，2010，140(6)：821-832.

[5] THOMAS P G，DASH P，ALDRIDGE J R Jr，et al.The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1[J].Immunity，2009，30(4)：566-575.

[6] MURUVE D A，PéTRILLI V，ZAISS A K，et al.The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response[J].Nature，2008，452(7183)：103-107.

[7] KANNEGANTI T D，BODY-MALAPEL M，AMER A，et al.Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA[J].JBiolChem，2006，281(48)：36560-36568.

[8] BI J，SONG S，F(xiàn)ANG L，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces IL-1β production depending on TLR4/MyD88 pathway and NLRP3 inflammasome in primary porcine alveolar macrophages[J].MediatorsInflamm，2014，2014：403515.

[9] ALLEN I C，SCULL M A，MOORE C B，et al.The NLRP3 inflammasome mediatesinvivoinnate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA[J].Immunity，2009，30(4)：556-565.

[10] ICHINOHE T，LEE H K，OGURA Y，et al.Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses[J].JExpMed，2009，206(1)：79-87.

[11] STASAKOVA J，F(xiàn)ERKO B，KITTEL C，et al.Influenza A mutant viruses with altered NS1 protein function provoke caspase-1 activation in primary human macrophages，resulting in fast apoptosis and release of high levels of interleukins 1beta and 18[J].JGenVirol，2005，86(Pt 1)：185-195.

[12] KOMUNE N，ICHINOHE T，ITO M，et al.Measles virus V protein inhibits NLRP3 inflammasome-mediated interleukin-1β secretion[J].JVirol，2011，85(24)：13019-13026.

[13] SHI X，ZHANG X，WANG F，et al.The zinc-finger domain was essential for porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein-1α to inhibit the production of interferon-β[J].JInterferonCytokineRes，2013，33(6)：328-334.

[14] SNIJDER E J，KIKKERT M，F(xiàn)ANG Y.Arterivirus molecular biology and pathogenesis[J].JGenVirol，2013，94(Pt 10)：2141-2163.

[15] SONG C，KRELL P，YOO D.Nonstructural protein 1α subunit-based inhibition of NF-κB activation and suppression of interferon-β production by porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virology，2010，407(2)：268-280.

[16] SUBRAMANIAM S，BEURA L K，KWON B，et al.Amino acid residues in the non-structural protein 1 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus involved in down-regulation of TNF-α expressioninvitroand attenuationinvivo[J].Virology，2012，432(2)：241-249.

[17] SUN Y，XUE F，GUO Y，et al.Crystal structure of porcine reproductive and respiratory syndrome virus leader protease Nsp1alpha[J].JVirol，2009，83(21)：10931-10940.

[18] BRYAN N B，DORFLEUTNER A，ROJANASAKUL Y，et al.Activation of inflammasomes requires intracellular redistribution of the apoptotic speck-like protein containing a caspase recruitment domain[J].JImmunol，2009，182(5)：3173-3182.

[19] CHUANG Y T，LIN Y C，LIN K H，et al.Tumor suppressor death-associated protein kinase is required for full IL-1β production[J].Blood，2011，117(3)：960-970.

(編輯 白永平)

The Zinc-Finger Domain is Essential for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Nonstructural Protein 1α(nsp1α) to Inhibit the NLRP3 Inflammasome

WANG Chao1，2，5，SHI Xi-bao2，4，WANG Li2，CHEN Jing2，SI Chao-chao2，WANG Ai-ping6，DENG Rui-guang2，ZHANG Gai-ping1，2，3*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；4.CollegeofLifeSciences，HenanNormalUniversity，Xinxiang453007，China；5.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China；6.DepartmentofBioengineering，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

Porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) is an important viral infectious disease in swine industry worldwide.The causative agent is porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)，which can inhibit host innate and adaptive immune response，cause immunosuppression，and lead to persistent infection.So it is difficult to control and eradicate PRRS.As a critical part of innate immune，NLRP3 inflammasome plays an extremely important role in host anti-viral immunity.Previous studies have shown that PRRSV activated the NLRP3 inflammasome.However，whether there are components of PRRSV which suppress NLRP3 inflammasome remains unknown.Therefore，in the present study，we first reconstructed NLRP3 inflammasome through co-transfecting expression plasmids encoding NLRP3，ASC，procaspase-1，and pro-IL-1β in HEK293T cells which are deficient in endogenous inflammasomes.Then，HEK293T cells and porcine alveolar macrophages(PAMs) were transfected with expression plasmid encoding nsp1α of PRRSV.The results indicated that nsp1α can apparently block NLRP3 inflammasome activation.The further mutation experiments demonstrated that deletion or mutation of Zinc-Finger(ZF) domain in N-terminal of nsp1α fails to activate the NLRP3 inflammasome.Our study first demonstrated that nsp1α had the ability to suppress the NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β secretion and ZF domain was essential for nsp1α to inhibit the IL-1β induction.Our study reveals a new mechanism that PRRSV antagonize host innate immune responses and may provide some insights into the research on molecular targets of anti-PRRSV drugs and prevention of PRRS.

porcine reproductive and respiratory syndrome virus；nsp1α；ZF domain；NLRP3 inflammasome；IL-1β

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.016

2015-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31302073)；國(guó)家自然基金重大基礎(chǔ)研究計(jì)劃 (31490600)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2014CB542700)；國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(31472177)

王 超(1985-)，男，河南鶴壁人，博士生，主要從事分子病原學(xué)和免疫學(xué)研究，E-mail:y-y-c@163.com

*通信作者：張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，中國(guó)工程院院士，教授，博士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)及疫病快速檢測(cè)技術(shù)研究，E-mail: zhanggaiping2003@163.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)11-2032-08