高 婧,杜青波,譚艷芳,岳 歡,黃俊瓊,2
(1.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,貴州遵義563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,貴州遵義563099)
IL-31對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549表達(dá)CCL2的影響
高 婧1,杜青波1,譚艷芳1,岳 歡1,黃俊瓊1,2
(1.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,貴州遵義563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,貴州遵義563099)
目的通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究IL-31對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549表達(dá)趨化因子C-C趨化因子配體2(CCL2)的影響,探討IL-31在支氣管哮喘氣道炎癥中的作用。方法體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549,用不同濃度(10、50、100 ng/mL)IL-31作用A549細(xì)胞、相同濃度(10 ng/mL)IL-31作用A549細(xì)胞不同時(shí)間(12、24、36 h),收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,熒光定量PCR法分析趨化因子CCL2 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果不同濃度IL-31作用于A549細(xì)胞后,趨化因子CCL2的表達(dá)較正常未處理組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);10 ng/mL IL-31作用A549細(xì)胞后,不同時(shí)間段CCL2的表達(dá)均增高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論IL-31作用于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549后,趨化因子CCL2的表達(dá)明顯增高,表明IL-31可能誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞分泌趨化因子參與哮喘氣道炎癥過(guò)程。
趨化因子CCL2; 白細(xì)胞介素類(lèi); 肺泡/細(xì)胞學(xué); 哮喘; 氣管炎
支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是氣道的慢性炎癥,是多種炎性細(xì)胞的長(zhǎng)期浸潤(rùn)和聚集。而趨化因子在激活淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞,誘導(dǎo)其遷移、黏附和建立化學(xué)趨化梯度的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CC趨化因子配體 2(CCL2)是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)最早的、有活性的趨化因子,是CC類(lèi)趨化因子家族的成員。CCL2在哮喘氣道上皮和肺泡灌洗液(BALF)中高表達(dá),能趨化、激活嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞,促使其釋放大量組胺和白三烯等,可能參與哮喘的急性發(fā)作和氣道炎癥的形成。IL-31在炎性疾病中發(fā)揮重要的作用,有研究證明,IL-31可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IL-31作用人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549,熒光定量PCR檢測(cè)A549細(xì)胞CCL2的分泌情況,進(jìn)一步探討IL-31與哮喘氣道炎癥的關(guān)系。
1.1 材料 人IL-31(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司),RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自HYclone公司,總RNA提取試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自天根生物公司,A549細(xì)胞由本院微生物教研室王歡教授所贈(zèng)。
1.2 方法
1.2.1 A549細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 將液氮中凍存的裝有A549細(xì)胞的凍存管取出后,放入37℃溫水中使其迅速融化。移液器轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),加入RPMI1640培養(yǎng)液,1 000 r/min、離心3~5 min,倒掉廢液,加入新的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中,放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
1.2.2 A549的傳代 A549細(xì)胞是貼壁細(xì)胞,當(dāng)鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時(shí),用無(wú)菌PBS清洗2次,加入0.25%胰蛋白酶消化液0.2~0.5 mL,室溫下平置3~5 min,見(jiàn)瓶底細(xì)胞變圓、脫落時(shí),加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,吹打細(xì)胞成懸液,轉(zhuǎn)移至新的離心管,1000r/min、離心3~5min,棄廢液,加入新的培養(yǎng)液,按1∶2傳代后放入CO2培養(yǎng),適時(shí)換液。
1.2.3 不同濃度IL-31作用A549相同時(shí)間 將A549細(xì)胞傳至第2代,按1×105個(gè)/瓶培養(yǎng)于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,細(xì)胞同一化12 h,然后加入不同濃度的人IL-31,濃度依次為10、50、100 μg/mL,置入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
1.2.4 相同濃度IL-31作用A549不同時(shí)間 將A549細(xì)胞傳至第2代,按1×105個(gè)/瓶培養(yǎng)于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,細(xì)胞同一化12 h,加入相同濃度(10 μg/mL)的IL-31作用于同一化的細(xì)胞,在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12、24、36 h。
1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)CCL2的表達(dá) 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后取0.5 mL的反應(yīng)管配制20 μL RT-PCR反應(yīng)液:反應(yīng)管中依次加入滅菌蒸餾水7μL,CCL2的上、下游引物各0.5μL,熒光染料(SYBR premix Ex TaqTM)10 μL,DNA模板2μL,進(jìn)行兩步法熒光定量PCR:95℃、3 min;95℃、10 s;57℃、30 s;55℃、3s。CCL2引物:上游5′-CTTCTGTGCCTGCTGCTCATA-3′,下游5′-CTTTGGGACACTTGCTGCTG-3′。β-actin引物:上游5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC3′,下游5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′。擴(kuò)增結(jié)果用熒光定量PCR相對(duì)定量2-ΔΔCt法的計(jì)算方法進(jìn)行分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,兩組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 不同濃度(10、50、100 ng/mL)IL-31作用A549細(xì)胞后CCL2的表達(dá) 熒光定量PCR分析顯示,不同濃度IL-31作用于A549細(xì)胞后CCL2的表達(dá)均較未處理組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.16、2.35、2.30,P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。
表1 不同濃度IL-31對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響(±s)
表1 不同濃度IL-31對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響(±s)
注:-表示無(wú)此項(xiàng);與未處理組比較,t=2.16、2.35、2.30,aP<0.05。
組別未處理組IL-31組(ng/mL)10 50 100△Ct(CCL2-β-actin)10.39±0.85△△Ct 2-△△Ct--8.71±1.27a9.23±0.60a10.00±1.42a-1.68 -1.16 -0.39 3.21 2.23 1.31
圖1 各濃度組A549細(xì)胞CCL2的表達(dá)
2.2 IL-31不同作用時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響 通過(guò)熒光定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)相同濃度IL-31作用于A549細(xì)胞后CCL2的表達(dá)均較未處理組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.30、2.36、2.28,P<0.05),見(jiàn)表2、圖2。
表2 IL-31作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響(±s)
表2 IL-31作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響(±s)
注:-表示無(wú)此項(xiàng);與未處理組比較,t=2.30、2.36、2.28,aP<0.05。
組別未處理組IL-31組作用時(shí)間(h)12 24 36△Ct(CCL2-β-actin) △△Ct 2-△△Ct10.39±0.85--8.88±1.06a8.71±1.27a8.51±1.26a-1.51 -1.68 -1.88 2.85 3.21 3.69
圖2 IL-31作用不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)CCL2的影響
哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病,其主要病理生理基礎(chǔ)表現(xiàn)為肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)。哮喘的發(fā)病機(jī)制有很多種,其中對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),多種細(xì)胞因子,包括IL、炎癥介質(zhì)、趨化因子等參與氣道慢性炎癥的調(diào)節(jié)。
IL在哮喘中發(fā)揮重要作用,主要包括參與炎癥細(xì)胞的成熟和活化、調(diào)節(jié)趨化因子合成和分泌等。其中IL-6是一種重要的促炎性細(xì)胞因子,在多種炎性反應(yīng)中均增高,參與調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡,在哮喘中發(fā)揮著重要作用[2]。IL-31是于2004年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子,為一個(gè)具有4個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的單鏈分子[3],主要功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)造血,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子、趨化因子分泌[1,4-5],屬于IL-6家族的成員,主要由激活的Th2細(xì)胞分泌。研究發(fā)現(xiàn),IL-31與過(guò)敏性疾病關(guān)系密切,在哮喘小鼠模型中,肺組織和支氣管脫落細(xì)胞IL-31R的表達(dá)明顯增高[3]。表明其在哮喘發(fā)作中IL-31可能發(fā)揮重要作用。
在哮喘氣道慢性炎癥的形成中,趨化因子的作用占重要地位。趨化因子是一組具有趨化作用的細(xì)胞因子,能吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部,參與免疫調(diào)節(jié)。趨化因子對(duì)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞均有趨化作用,在炎癥、變態(tài)反應(yīng)等疾病中均有趨化因子及其受體的參與。與哮喘氣道慢性炎癥的形成有重要聯(lián)系的趨化因子主要有兩大類(lèi),CC趨化因子和CXC家族。CCL2屬于CXC家族,CCL2與其相應(yīng)的趨化因子受體CC趨化因子受體2(CCR2)結(jié)合后可活化單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞,并向炎癥部位聚集。IL-4與IL-31有非常相似的生物學(xué)活性,可以直接促進(jìn)IgE合成,引起嗜酸性粒細(xì)胞聚集、黏液分泌增加,導(dǎo)致氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性[6-8]。體外實(shí)驗(yàn)表明,IL-4與IL-31聯(lián)合可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)CCL2[3]。Schneider等[9]證實(shí),由支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2可能有助于加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。有研究發(fā)現(xiàn),IL-31能增強(qiáng)一些趨化因子的分泌,如巨噬細(xì)胞來(lái)源的趨化因子、胸腺和活化趨化因子及T細(xì)胞活化蛋白-3等,并且趨化因子的分泌與IL-31的關(guān)系呈正相關(guān)[10]。另有研究證實(shí),IL-31刺激人的支氣管上皮細(xì)胞分泌趨化因子的能力增強(qiáng),并且與時(shí)間和濃度呈依賴(lài)性[1]。
作者在前期研究中發(fā)現(xiàn),哮喘小鼠肺組織中趨化因子CCL2表達(dá)增高[11]。本研究中,作者用IL-31作用于肺組織來(lái)源的A549細(xì)胞,觀察趨化因子CCL2的分泌情況。采用不同濃度IL-31誘導(dǎo)A549細(xì)胞后,用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞分泌CCL2的情況。結(jié)果顯示,在IL-31誘導(dǎo)細(xì)胞后,不同濃度IL-31均能上調(diào)CCL2的表達(dá)。采用同樣方法,用10 μg/mL IL-31誘導(dǎo)A549細(xì)胞,于12、24、36 h后CCL2的分泌與未處理組相比均增加,這一結(jié)果與IL-31募集、活化趨化因子的生物活性有關(guān)系。說(shuō)明IL-31可誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞分泌趨化因子參與哮喘氣道炎癥。IL-31促使趨化因子分泌增多,趨化炎癥細(xì)胞炎癥部位,如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等,促進(jìn)這些炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì),引起氣管平滑肌收縮、細(xì)胞通透性增加、炎性物質(zhì)滲出增多、管壁增厚、管腔變窄,形成氣道的慢性炎癥。長(zhǎng)期、反復(fù)的炎癥刺激導(dǎo)致氣管上皮結(jié)構(gòu)改變,氣道組織結(jié)構(gòu)重組,加重氣管阻力,增加呼吸做功,最終加重哮喘的癥狀。
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Effect of IL-31 on the expression of CCL2 in typeⅡalveolar epithelial cells A549
Gao Jing1,Du Qingbo1,Tan Yanfang1,Yue Huan1,Huang Junqiong1,2
(1.Department of Clinical Laboratory,Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou 563099,China;2.Department of Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou 563099,,China)
ObjectiveTo explore the effect of of IL-31 on airway inflammation of bronchial asthma by studying the effect of IL-31 on the expression of CCL2 in typeⅡalveolar epithelial cells A549 in vitro.MethodsThe typeⅡalveolar epithelial cells A549 were cultured in vitro,with the different-concentration IL-31 solution including 10,50,100 ng/mL acting on them and the same concentration IL-31(10 ng/mL)acting on the them for different times including 12,24 h and 36 h,and then collected the cells and extracted the total cellular RNA.The mRNA expression of chemokine CCL2 were measured by fluorescent real-time PCR assay.ResultsCompared with the normal treatment group,the mRNA expression of chemokine CCL2 was significantly increased with different concentrations of IL-31 impacting on the A549 cells.The difference was statistically significant(P<0.05);The mRNA expression of chemokine CCL2 was increased with 10 ng/mL IL-31 impacting on the A549 cells at different time periods.The difference had statistical significance(P<0.05).ConclusionThe expression of chemokine CCL2 is obviously increased with the impact of IL-31 acting in type II alveolar epithelial cells A549,which indicates that IL-31 may probably induce lung tissue cells to secrete chemokines involving in asthmatic airway inflammation.
Chemokine CCL2; Interleukins; Pulmonary alveoli/cytology; Asthma; Tracheitis
10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.001
:A
:1009-5519(2015)08-1121-03
2014-12-30)
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高婧(1988-),女,河南許昌人,碩士研究生,主要從事臨床免疫方面研究;E-mail:478729521@qq.com。
黃俊瓊(E-mail:junqiongh@aliyun.com)。
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