褪黑素受體在未妊娠和妊娠牦牛子宮表達(dá)的研究

霍生東，袁其建，盧建雄，臧榮鑫，楊具田，張濤杰，阿依木古麗，劉俊林，馬忠仁，龍瑞軍

(1.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州730000； 2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030)

褪黑素受體在未妊娠和妊娠牦牛子宮表達(dá)的研究

霍生東1，2，袁其建2，盧建雄2，臧榮鑫2，楊具田2，張濤杰2，阿依木古麗2，劉俊林2，馬忠仁2，龍瑞軍1*

(1.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州730000； 2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030)

旨在研究褪黑素對(duì)妊娠牦牛子宮的調(diào)控作用，采用real-time PCR法和免疫組織化學(xué)S-P法，對(duì)未妊娠和妊娠不同時(shí)期牦牛子宮中褪黑素受體(MT1)mRNA和褪黑素受體(MT1)蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：牦牛未妊娠和妊娠的不同時(shí)期，牦牛子宮基質(zhì)細(xì)胞(SC)和肌層平滑肌細(xì)胞(MM)中均有MT1蛋白表達(dá)(P>0.05)；血管內(nèi)皮細(xì)胞(EBV)和血管平滑肌細(xì)胞(VSM)中的MT1蛋白表達(dá)，在妊娠28～35 d差異不顯著，隨妊娠時(shí)間的增加，MT1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；腺上皮細(xì)胞(GE)中的MT1蛋白,在妊娠初期(妊娠28～35 d)差異不顯著，妊娠50～60 d時(shí)，差異顯著(P<0.05)，妊娠90～100 d時(shí)，差異極顯著(P<0.01)。而在腔上皮細(xì)胞(SE)中，MT1蛋白表達(dá)量在妊娠28～35 d比未妊娠時(shí)低(P<0.05)，而這種趨勢(shì)隨妊娠時(shí)間的增加繼續(xù)降低(P<0.01)。未妊娠牦牛子宮中MT1 mRNA表達(dá)量顯著高于妊娠牦牛(P<0.01)。綜上表明，在妊娠期，牦牛子宮對(duì)褪黑素的需求量降低，褪黑素主要作用于牦牛GE，調(diào)節(jié)子宮腺功能，使牦牛子宮產(chǎn)生適應(yīng)妊娠的生理反應(yīng)。

牦牛；褪黑素受體；妊娠期；子宮；免疫組織化學(xué)；real-time PCR

牦牛是生活在青藏高原低氧高海拔(3～5 km)地區(qū)非常重要的草食哺乳動(dòng)物，為青藏高原地區(qū)牧民提供肉、乳等生活物資，屬于國(guó)家珍稀種畜資源[1]。牦牛是生活在青藏高原的大型哺乳動(dòng)物，每年7～8月份自然交配，次年3～4月份產(chǎn)犢，平均妊娠期250 d[2-3]。褪黑素是由松果體分泌的多肽類(lèi)激素，是調(diào)節(jié)牦牛季節(jié)性繁殖的主要因子。褪黑素受體在牦牛松果體、下丘腦、垂體、卵巢中都有表達(dá)，參與牦牛季節(jié)性發(fā)情的啟動(dòng)[4]。通過(guò)制造小鼠宮內(nèi)缺血、缺氧模型，同步給予0.01 g·kg-1褪黑素治療，證實(shí)褪黑素可以通過(guò)凋亡調(diào)控基因水平對(duì)宮內(nèi)缺氧胎鼠腦損傷起到保護(hù)作用[5]。褪黑素作為一種重要生殖激素，發(fā)揮作用主要是通過(guò)G-蛋白偶聯(lián)的褪黑素受體來(lái)完成。在妊娠過(guò)程中，子宮要發(fā)生一系列的變化來(lái)保證妊娠的完成，這些變化的發(fā)生，很大程度上是通過(guò)子宮腺分泌的激素來(lái)完成[6]。子宮腺細(xì)胞在妊娠8～12 d開(kāi)始增生，之后減少。子宮肌細(xì)胞第9天開(kāi)始增生，持續(xù)到妊娠的第16天。免疫組化研究顯示，子宮腺在發(fā)育過(guò)程中，孕酮受體定位于蛻膜細(xì)胞、肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。子宮腺細(xì)胞增殖、分化和維持都受到對(duì)孕酮敏感的基質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)[7]。妊娠過(guò)程中，自然殺傷細(xì)胞[8]、溶血磷脂酸[9]、維生素E[10]、NODAL[11]都參與了妊娠的維持和發(fā)展，他們通過(guò)調(diào)節(jié)孕酮來(lái)完成對(duì)妊娠過(guò)程的調(diào)節(jié)。褪黑素含量的變化是通過(guò)光照時(shí)間來(lái)調(diào)節(jié)，因此，研究褪黑素受體蛋白及mRNA在牦牛子宮中分布和表達(dá)情況，對(duì)闡述褪黑素參與牦牛繁殖過(guò)程的機(jī)理顯得尤為重要。

本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)(S-P法)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(real-time PCR)相結(jié)合的方法，研究未妊娠和妊娠期不同階段，牦牛子宮組織中MT1蛋白定位和MT1 mRNA表達(dá)量，來(lái)探討褪黑素對(duì)妊娠期牦牛子宮調(diào)控作用，及其參與牦牛的生殖生理和妊娠過(guò)程的調(diào)控機(jī)理，這對(duì)于揭示牦牛在青藏高原高海拔、高寒低氧環(huán)境下，繁殖適應(yīng)機(jī)理及其妊娠維持具有十分重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

挑選未妊娠、妊娠28～35 d、妊娠50～60 d、妊娠90～100 d牦牛各6頭，屠宰后迅速取出子宮，一部分裝入RNA保護(hù)液中備用，另一部分用生理鹽水沖洗3次，40 g·L-1多聚甲醛保存?zhèn)溆?。牦牛妊娠期，根?jù)霍生東[12]的研究報(bào)告確定。

1.2 主要試劑

KIT-9710即用型免疫組化UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒(鼠/兔)(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；MT1(上海越研生物科技有限公司)，多聚賴(lài)氨酸(Poly-L-Lysine)、抗體稀釋液及棕色DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，牛血清白蛋白(上海生化科技有限公司)，RNA Sample Protector、RNAiso Plus試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNATaq聚合酶、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、RNase-free水(寶生物工程(大連)有限公司)，DNA Marker(天根生化科技有限公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)MT1蛋白

免疫組織化學(xué)染色程序按照SP試劑盒進(jìn)行。首先用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行高壓抗原修復(fù)2 min，冷卻后使用SP試劑盒中A、B、C和D液依次孵育10～15 min，并在B液之后用MT1工作液(按1∶70稀釋)37℃孵育1 h，D液之后用棕色DAB顯色試劑盒顯色3～5 min，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照以PBS液代替一抗，其余步驟同上。

將妊娠期不同階段的牦牛子宮切片，隨機(jī)選取每頭牦牛5張免疫組化染色的子宮切片，使用OLYMPUS-BX61數(shù)碼顯微鏡的拍照攝像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。使用Image pro-Plus6.0(IPP6.0)圖像分析軟件進(jìn)行光密度值(OD)測(cè)定分析，光密度值與MT1免疫陽(yáng)性產(chǎn)物程度呈正相關(guān)，即為光密度值(OD)越大，免疫產(chǎn)物陽(yáng)性程度越強(qiáng)。

1.4 RNA的分離及cDNA的合成

采用Trizol RNA提取試劑盒提取組織總RNA，提取后用分光光度計(jì)進(jìn)行純度檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，總反應(yīng)體積10 μL，37 ℃ 15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄酶失活。

1.5 MT1引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的已登錄的牦牛MT1(XM614283.3)基因序列，利用Oligo 6.0軟件在線設(shè)計(jì)引物，采用牦牛β-actin(DQ838049)作為內(nèi)參基因，由寶生物工程(大連)有限公司合成，各項(xiàng)參數(shù)如表1所示。

表1 MT1引物序列與Real-time PCR反應(yīng)參數(shù)

Table1 The primer sequences and real-time PCR amplification parameters of MT1

基因Genes登錄號(hào)Accession序列(5'-3')Primer長(zhǎng)度/bpSize退火溫度/℃AnnealingtemperatureMT1XM614283.3F:CACTCGTCATCATTCCR:TCCACTCCAGTCTTCT1853.5β-actinDQ838049F:GGACAGGATTGACAGAR:GCTCCACCAACTAAGA1855.0

1.6 熒光定量real-time PCR

采用iCycleer iQ5 real-time Detection System進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。25 μL PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 1×SYBRP remix Ex Tap，3.0 μL cDNA，1.0 μL上下游引物，8.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)，61 ℃ 30 s。每個(gè)樣品3次重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1MT1在未妊娠和妊娠不同時(shí)期牦牛子宮中的表達(dá)

采用免疫組化S-P法，對(duì)未妊娠、妊娠28～35 d、妊娠50～60 d、妊娠90～100 d牦牛子宮中MT1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，陽(yáng)性細(xì)胞顯示棕色。MT1蛋白表達(dá)變異主要發(fā)生在牦牛子宮的SE、GE、VSM、EVB、SC、MM，如圖1所示。

A.未妊娠;B.妊娠28～35 d;C.妊娠50～60 d;D.妊娠90～100 d；SE.腔上皮；SC.基質(zhì)細(xì)胞；EBV.血管內(nèi)皮；VSM.血管平滑??；GE.腺上皮；MM.肌層平滑肌A.Nonpregnancy；B.28-35 day of pregnancy;C.50-60 day of pregnancy；D.90-100 day of pregnancy.SE.Surface epithelium;SC.Stromal cells；EBV.Endometrial blood vessel;VSM.Vascular smooth muscle;GE.Gland epithelium;MM.Myometrial smooth muscle cells圖1 MT1蛋白在未妊娠和妊娠牦牛子宮中表達(dá)Fig1 Expression of MT1 in the uterus during pregnancy and nonpregnancy of yak

使用Image pro-Plus 6.0(IPP 6.0)圖像分析軟件進(jìn)行光密度值(OD)測(cè)定分析(表2)， SE中MT1蛋白從妊娠28～35 d開(kāi)始降低(P<0.05)，隨著妊娠的進(jìn)行，MT1蛋白在SE中的表達(dá)繼續(xù)降低(P<0.01)。而GE中MT1蛋白從妊娠28～35 d開(kāi)始增加(P>0.05),妊娠50～60 d時(shí)差異顯著(P<0.05)，妊娠90～100 d時(shí)，差異極顯著(P<0.01)。在SC和MM中，MT1蛋白沒(méi)有發(fā)生顯著的變化(P>0.05)。在EBV和VSM中，MT1蛋白在妊娠28～35 d時(shí)沒(méi)有變化(P>0.05)，妊娠50～60 d和妊娠90～100 d時(shí)，MT1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

表2 MT1蛋白在不同妊娠階段牦牛子宮中的表達(dá)量

Table2 Expression of MT1 in yak uterus during the different stages of pregnancy

妊娠時(shí)間Stageofpregnancy腔上皮SE腺上皮GE肌層平滑肌MM基質(zhì)細(xì)胞SC血管內(nèi)皮EBV血管平滑肌VSM未妊娠Nonpregnancy0.65±0.04a0.51±0.05a0.38±0.030.46±0.030.48±0.03a0.39±0.04a妊娠28～35d28-35daysofpregnancy0.52±0.03b0.54±0.03a0.40±0.020.43±0.020.51±0.05a0.40±0.03a妊娠50～60d50-60daysofpregnancy0.45±0.02c0.63±0.05b0.36±0.030.39±0.050.58±0.04b0.45±0.02b妊娠90～100d90-100daysofpregnancy0.40±0.04c0.69±0.04c0.42±0.010.41±0.010.61±0.03b0.52±0.04b

表中數(shù)據(jù)為陽(yáng)性產(chǎn)物光密度值。同一列相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05);相間字母表示差異極顯著(P<0.01)

The data in the table denote OD value of immunoreactive products.The same superscript letters in the same column mean that there was no significant difference (P>0.05),The different superscript letters in the same column mean that there was significant difference between groups(P<0.05)；The interval superscript letters in the same column show that there was highly significant (P<0.01)

2.2MT1 mRNA在未妊娠與妊娠期牦牛子宮中的表達(dá)變化

從純化后的總RNA中抽取2 μL進(jìn)行純度和完整性的檢測(cè)，用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果28S和18S均為較明亮的、無(wú)拖尾的條帶(圖2)，D260 nm/D280 nm均為1.934～2.041。說(shuō)明總RNA完整且純度較高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。通過(guò)real-time PCR對(duì)未妊娠、妊娠28～35 d、妊娠50～60 d、妊娠90～100 d，牦牛子宮中MT1 mRNA含量進(jìn)行

圖2 牦牛子宮總RNA提取的結(jié)果Fig.2 Extraction of total RNA from uterus of yak

表3MT1及β-actin的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)

Table 3 Linear relationship and correlation coefficient ofMT1 andβ-actin

基因Gene線性方程Linearequation相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientMT1y=-3.1740x+41.021r2=0.9812β-actiny=-3.9871x+28.651r2=0.9905

y.CT值;x.lg起始DNA濃度

y.CT value；x.lg initial concentration of DNA

檢測(cè)。獲得的線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。在未妊娠、妊娠28～35 d、妊娠50～60 d、妊娠90～100 d牦牛子宮中均有MT1 mRNA的表達(dá)。未妊娠牦牛子宮中MT1 mRNA表達(dá)量顯著高于妊娠28～35 d、妊娠50～60 d、妊娠90～100 d時(shí)的表達(dá)量(P<0.01)。妊娠后MT1 mRNA在牦牛子宮中的表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生顯著的變化(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

A．未妊娠；B.妊娠28～35 d；C.妊娠50～60 d；D.妊娠90～100 dA.Nonpregnancy；B.28-35 day of pregnancy;C.50-60 day of pregnancy；D.90-100 day of pregnancy圖3 妊娠期不同階段牦牛子宮MT1 mRNA的含量Fig.3 Content of MT1 mRNA in uterus of yak

3 討 論

牦牛是生活在青藏高原的大型哺乳動(dòng)物，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了適應(yīng)青藏高原環(huán)境的生理機(jī)制[13-14]。褪黑素是由松果體產(chǎn)生并受光照調(diào)節(jié)的一類(lèi)重要激素，牦牛在每年7月份開(kāi)始進(jìn)入發(fā)情季節(jié)，而北半球每年7月份夏至之后，也正是晝短夜長(zhǎng)開(kāi)始的時(shí)間，正好和牦牛發(fā)情季節(jié)的開(kāi)始相吻合[15]。子宮腺在妊娠過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，尤其是在妊娠識(shí)別和維持過(guò)程中，子宮腺通過(guò)分泌信息分子，調(diào)節(jié)子宮的生理狀態(tài)，使其適應(yīng)妊娠過(guò)程[16-17]。妊娠過(guò)程中，孕酮是調(diào)節(jié)子宮的重要因子，而孕酮的來(lái)源除了來(lái)自黃體，還有一部分來(lái)自于子宮，來(lái)自子宮的孕酮，在妊娠開(kāi)始后，GE中MT1蛋白的表達(dá)即開(kāi)始升高(表2)，說(shuō)明褪黑素從開(kāi)始妊娠到妊娠90～100 d都發(fā)揮了重要的作用。這種作用，主要是調(diào)節(jié)子宮腺，進(jìn)而對(duì)孕酮、雌激素等生殖激素的分泌產(chǎn)生影響，使子宮的變化適應(yīng)妊娠過(guò)程[18-19]，其他因子也要直接作用于子宮，對(duì)子宮腔上皮、血管等進(jìn)行調(diào)節(jié)[20-22]。而MT1蛋白在SE中的表達(dá)可以看出，褪黑素對(duì)于妊娠牦牛的子宮腔來(lái)說(shuō)是個(gè)抑制因子，妊娠28～35 d時(shí)，MT1蛋白還未發(fā)生變化，隨著妊娠過(guò)程的進(jìn)行，子宮腔上皮MT1蛋白的表達(dá)逐漸減少，到妊娠90～100 d時(shí)，這種變化差異極顯著(P<0.01)(表2)。MT1蛋白在EBV和VSM中的表達(dá)在妊娠50～60 d后開(kāi)始升高，說(shuō)明褪黑素參與了對(duì)血管功能的調(diào)節(jié)，使其適應(yīng)牦牛在妊娠過(guò)程中發(fā)生的生理反應(yīng)。通過(guò)對(duì)MT1蛋白和mRNA分析發(fā)現(xiàn)，牦牛妊娠后子宮對(duì)褪黑素的需求量降低，但在牦牛子宮GE中，褪黑素需求量升高。

綜上所述，妊娠過(guò)程中子宮對(duì)褪黑素的需求量降低，但在GE中，褪黑素需求量升高。這種升高可以解釋為褪黑素調(diào)節(jié)子宮分泌信息分子，參與妊娠的建立和維持。SE中褪黑素的需求量下降，可以推測(cè)為，褪黑素的直接作用對(duì)妊娠是抑制因子。褪黑素在妊娠過(guò)程中參與了哪些信息分子的調(diào)節(jié)？褪黑素對(duì)妊娠后SE的作用機(jī)制？這些問(wèn)題的解決，為研究牦牛生殖生理提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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(編輯 程金華)

Melatonin Receptor Expression in Uterus during Pregnancy，Nonpregnancy of Yak

HUO Sheng-dong1,2，YUAN Qi-jian2，LU Jian-xiong2，ZANG Rong-xin2，YANG Ju-tian2， ZHANG Tao-jie2，Ayimuguli2，LIU Jun-lin2，MA Zhong-ren2，LONG Run-jun1*

(1.CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnologyofLanzhouUniversity，Lanzhou730000，China； 2.CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou730030，China)

To better understand the role of melatonin receptor (MT1) during pregnancy of yak，the expression level of MT1 protein andMT1 mRNA in uterus of yak (Bosgrunniens)during pregnant and nonpregnant stage was determined using Streptavidin-Peroxidase (S-P) immunohistochemical method and real-time PCR，respectively.The results showed that MT1 protein expressed in stromal cells and myometrial smooth muscle cells during pregnancy and nonpregnant stage (P>0.05).The expression level of MT1 protein in endometrial blood vessel and vascular smooth muscle had no significant difference on 28-35 day of pregnancy compared with that of non-pregnant yak，however，it was increasing with the stage of pregnancy (P<0.05).Meanwhile，MT1 protein expression was not significant different on 28-35 day of pregnancy in gland epithelium，but had dramatic increases on 50-60 day of pregnancy (P<0.05) and 90-100 day of pregnancy (P<0.01).In surface epithelium cells，the expression of MT1 protein was lower on 28-35 day of pregnancy than that of nonpregnant stage (P<0.05) and had significant decreases on 50-60 day of pregnancy (P<0.01) and 90-100 day of pregnancy (P<0.01).In addition，MT1 mRNA expression was lower in pregnant uterus than that of nonpregnant stage (P<0.01).The results indicated that the decreasedMT1 mRNA expression in uterus during pregnancy might be associated with gland epithelium cell function for maintenance of pregnancy.

yak (Bosgrunniens)；melatonin receptor (MT1)；pregnancy period；uterus；immunohistochemistry；real-time PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.009

2014-07-31

甘肅省青年科技基金項(xiàng)目(1208RJYA020);國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31260589)

霍生東(1979-)，男，甘肅金塔人，副教授，博士生，主要從事牦牛生殖生理研究，E-mail:huoshd12@lzu.edu.cn；Tel：0931-4512903

S823.8+5.2

A

0366-6964(2015)02-0239-06

*通信作者：龍瑞軍，教授，E-mai：longrj@lzu.edu.cn