黃芩苷對(duì)ApoE基因敲除小鼠早期動(dòng)脈粥樣斑塊中MMP-9表達(dá)的影響*

劉小軍 萬(wàn)招飛 王新宏 趙 娜 袁祖貽

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(西安710061)

·論著·基礎(chǔ)研究·

黃芩苷對(duì)ApoE基因敲除小鼠早期動(dòng)脈粥樣斑塊中MMP-9表達(dá)的影響*

劉小軍 萬(wàn)招飛 王新宏△趙 娜▲袁祖貽#

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科(西安710061)

目的： 探討黃芩苷對(duì)ApoE基因敲除小鼠早期動(dòng)脈粥樣斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響。方法： 24只8周齡ApoE -/-小鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)8周后隨機(jī)分為對(duì)照組、苷低劑量和高劑量組，每組8只。灌胃8周后處死，酶法檢測(cè)血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度；用ELISA測(cè)血清中MMP-9的表達(dá)水平;通過(guò)RT-PCR和 Western blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈斑塊組織中MMP-9的表達(dá)情況。結(jié)果： 與對(duì)照組相比，干預(yù)組小鼠血清中TC水平降低(P<0.05), 血清中LDL-C水平明顯降低(P<0.01)，高劑量組較低劑量組降低的明顯(P<0.05)；各組小鼠血清中HDL-C及TG含量雖有變化但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芩苷干預(yù)組血清MMP-9較對(duì)照組表達(dá)水平低，高劑量組降低更顯著(P<0.05)；同時(shí)，黃芩苷干預(yù)組主動(dòng)脈斑塊中MMP-9 mRNA及蛋白水平較對(duì)照組降低明顯(P<0.01)，高劑量組降低尤為顯著(P<0.05)。結(jié)論： 黃芩苷可以降低ApoE -/-小鼠血清中血脂和MMP-9水平，并可降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-9表達(dá)，提示黃芩苷具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊作用。

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種以脂質(zhì)聚集和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性炎癥過(guò)程，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定或破裂可導(dǎo)致急性心腦血管事件如心梗、卒中等的發(fā)生[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶作為一類(lèi)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，參與血管管壁基質(zhì)的降解，促使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及斑塊的不穩(wěn)定[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶重要成員之一，與As 斑塊穩(wěn)定性尤為相關(guān)[3,4]。黃芩作為傳統(tǒng)中藥，在心血管疾病中有很重要的藥用價(jià)值。黃芩苷(Baicalin)是由黃芩干燥根中提取一種黃酮類(lèi)化合物，是黃芩的主要有效成分之一。既往研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具抗氧化、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎等作用[5～8]。本研究以apoE -/-小鼠為動(dòng)物模型，觀察黃芩苷對(duì)血清中及主動(dòng)脈斑塊MMP-9表達(dá)的影響，探討黃芩苷在穩(wěn)定AS早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的作用。

材料和方法

1 藥品和儀器 黃芩苷：四川廣漢植化公司，相對(duì)分子質(zhì)量446，純度98.5%，用生理鹽水配制成 25 mg/ml，加1mol/ml NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.3～7.4于密閉棕色容器中儲(chǔ)存。甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)生化試劑盒(浙江東鷗生物工程有限公司)；RNA提取試劑 Trizol購(gòu)自Invitrongen公司Step One Real-Time PCR System 美國(guó)ABI公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesisi Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司，SYBRGreen購(gòu)自Roche公司；MMP-9兔抗鼠一抗及MMP-9 ELESLL試劑盒均為(Santa Cruz Biotechnology公司)，HRP-山羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方式 24只C57BL/6J遺傳背景的ApoE -/-小鼠，8周齡，體重20±1.5g，雄性，購(gòu)自中國(guó)南京大學(xué)模式動(dòng)物遺傳研究中心，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流室(sPF級(jí)屏障環(huán)境)。高脂喂養(yǎng)8周后,隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、黃芩苷低劑量組和高劑量組，每組8只。黃芩苷低劑量組和高劑量組分別給予25、 50mg/kg·d黃芩苷，對(duì)照組則給予生理鹽水。每天定時(shí)灌胃1次，連續(xù)灌胃周期8w。

3 標(biāo)本制備 每組小鼠空腹過(guò)夜，晨起摘除眼球采4℃ 3000r離心10min分離血清儲(chǔ)存于-80℃待檢。采血后迅速開(kāi)胸，右心耳行小切口，左室插管，用無(wú)菌冰生理鹽水灌注循環(huán)，直至灌洗液清亮，直視下分離主動(dòng)脈根部。予-80℃儲(chǔ)藏的主動(dòng)脈組織。

4 血脂測(cè)定 根據(jù)血脂測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)血清TG、TC、LDL-C和HDL-C濃度。

5 血清中MMP-9檢測(cè) 應(yīng)用雙抗體夾心ELESLL試劑盒法檢測(cè)血漿MMP-9,具體操作按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

6 Real-time PCR 檢測(cè)MMP-9的mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取-80℃儲(chǔ)藏的主動(dòng)脈組織 mRNA，紫外分光光度法測(cè)定核酸的純度與濃度。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)MMP-9、β-actin基因序列設(shè)計(jì)引物， MMP-9上下游引物分別為： (forward), 5-AAG GAT GGT CTA CTG GCA C-3;(reverse) 5-AGA GAT TCT CAC TGG GGC-3, 產(chǎn)物長(zhǎng)度279 bp), β-actin 作為內(nèi)參其上下游引物分別為： (forward), 5-TCA TGA AGT GTG ACG TTG AC-3; (reverse) 5-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GC-3, 產(chǎn)物長(zhǎng)度285 bp)。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃4min預(yù)變性；95℃20s，60℃30s，72℃1min，最后72℃延伸5min，共40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本做復(fù)孔。取各組PCR產(chǎn)物 10μl，經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳80V 電壓電泳 35min，凝膠成像儀攝像,計(jì)算目標(biāo)條帶灰度，并以β- actinn 的灰度作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比。

7 Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈中MMP-9的蛋白表達(dá)水平 取相同部位等量主動(dòng)脈組織用含PMSF 的RIPA 裂解液在冰上裂解，4℃15000rmin離心5min；取上清液以BCA法測(cè)蛋白濃度；取等量蛋白與樣本緩沖液混合煮沸5min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h ,TBST洗膜,分別加入兔抗鼠MMP-9一抗(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次 每次15min 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1500)置室溫顯色1h,TBST洗膜3次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，應(yīng)用冷CCD照相機(jī)直接拍攝化學(xué)發(fā)光膜，Quality One 軟件(Bio-Rad)分析目標(biāo)帶的累積光密度值(IOD)，并與內(nèi)參β-actin 比較。

結(jié) 果

1 血清血脂含量變化 見(jiàn)表1。 小鼠在給予黃芩苷干預(yù)8周后與對(duì)照組相比，干預(yù)組小鼠血清中總膽固醇水平降低(P<0.05), 血清中低密度脂蛋白水平明顯降低(P<0.01)，黃芩苷高劑量組較低劑量組降低的明顯(P<0.05)；黃芩苷干預(yù)組血清中高密度脂蛋白及甘油三酯含量雖有變化但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠血脂水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，**P<0.01;與黃芩苷低劑量組比較，#P<0.05

2 黃芩苷對(duì)血清中MMP-9水平的影響 見(jiàn)表2。 在給予黃芩苷干預(yù)8周后，干預(yù)組小鼠血清中MMP-9表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0. 01)，其中黃芩苷高劑量組較低劑量組的MMP- 9表達(dá)低(P<0. 05)。

表2 各組小鼠血清中MMP-9的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與黃芩苷低劑量組比較，#P<0.05

3 黃芩苷對(duì)ApoE -/-小鼠主動(dòng)脈組織中MMP-9mRNA的影響 在黃芩苷高、低劑量組小鼠主動(dòng)脈組織中MMP-9mRNA的表達(dá)較對(duì)照組相比減少(P< 0. 01)，且高劑量組MMP- 9mRNA的表達(dá)低于低劑量組(P<0. 05)。

4 黃芩苷對(duì)主動(dòng)脈MMP-9蛋白表達(dá)的影響 在給予不同劑量黃芩苷干預(yù)8周后，無(wú)論高劑量組還是低劑量組的小鼠主動(dòng)脈MMP-9蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0. 01)，其中高劑量組 MMP- 9蛋白的表達(dá)比低劑量組低(P<0. 05)。

討 論

AS斑塊的不穩(wěn)定或破裂是導(dǎo)致腦卒中和急性冠狀動(dòng)脈綜合征的主要發(fā)病機(jī)制[1]。所以對(duì)AS 易損斑塊的干預(yù)對(duì)預(yù)防急性心腦血管事件有重要意義。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要是纖維帽及脂質(zhì)核構(gòu)成，纖維帽的厚度和脂質(zhì)核心的大小是決定斑塊穩(wěn)定性的重要因素。通過(guò)抑制脂質(zhì)向內(nèi)皮下聚集及對(duì)保持纖維帽一定厚度對(duì)維持AS斑塊穩(wěn)定具有重要作用。

MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶重要成員之一，主要降解細(xì)胞外型膠原和彈力纖維。在AS斑塊中，MMP-9主要由巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞所分泌，它可降解細(xì)胞外膠原及彈性蛋白，從而利于炎性細(xì)胞向內(nèi)皮下浸潤(rùn)，加速As進(jìn)程，同時(shí)導(dǎo)致原有斑塊的纖維帽變薄、甚至崩解，以致斑塊破裂。多項(xiàng)研究表明，在外周血及動(dòng)脈斑塊中MMP-9的高表達(dá)與AS斑塊穩(wěn)定性相關(guān)，是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的主要因素之一[9,10]。

黃芩苷(Baicalin)是從唇形科植物黃芩( Scutel laria baicalensis georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類(lèi)化合物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：其具有抗炎、抗氧化、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、降脂等作用，是通過(guò)抑制炎性因子分泌、促使如超氧化物歧化酶、抗過(guò)氧化氫酶、谷胱苷肽過(guò)氧化物酶等抗氧化的相關(guān)酶表達(dá)增高等發(fā)揮作用。楊偉忠等發(fā)現(xiàn)在大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞動(dòng)物模型中，黃芩苷通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)，改善腦神經(jīng)損害，然而有關(guān)黃芩苷對(duì)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-9表達(dá)的影響少有報(bào)道。

我們以ApoE -/-小鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)給予不同劑量黃芩苷干預(yù)，發(fā)現(xiàn)黃芩苷組較對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈及血清中MMP-9表達(dá)減低，同時(shí)血清中膽固醇及低密度脂蛋白降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故本研究表明黃芩苷可以降低ApoE基因敲除小鼠血清中血脂和MMP-9水平，并可降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-9表達(dá)。這可能是黃芩苷穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制之一。

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(收稿：2014-10-30)

Effects of Baicalin on the expression of Matrix Metalloproteinases-9 at early stage of atherosclerosis in Apolipoprotein E knockout mice

University(Xi’an 710061) Liu XiaojunWan ZhaofeiWang Xinhong et al

Department of Cardiovasology，the First Affiliated Hospital Medical School of Xi’an Jiao tong

Objective： To explore the effects of Baicalin on the expression of MMP-9 at early stage of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice(ApoE -/- ). Methods： Male 8-week-old ApoE-/- mice fed with high fat diet for 8 weeks were randomly divided into three groups (n=8 each) : control group, low-dose Baicalin treated group, high-dose Baicalin treated group. All the animals were fed for 8 weeks．After administered for 8 weeks, mice were sacrificed．serum TG、TC、LDL-C and HDL-C was measured. The serum MMP-9 concentration was measured by ELISA. The expression of aortic MMP-9 mRNA and protein in each group mice were determined by Real-time PCR and Western blot respectively．Results： Compared with control group, serum TC level in Baicalin treated groups were reduced (P<0.05), serum LDL-C level in Baicalin treated groups were reduced obviously (P<0.01), especially in high-dose Baicalin (P< 0.05),but The serum TG、HDL-C level did not have significant differences between groups. The level of serum MMP-9 in the Baicalin treated groups was lower than that in the control group, significantly in high-dose Baicalin (P<0.05). Meanwhile, the expression of aortic MMP-9 mRNA and protein detected by Real-time PCR and Western blot, decreased in Baicalin treated groups compared with that in control group (P< 0.01), which in the high-dose Baicalin treated group were reduced more (P< 0.05). Conclusion：The serum level of Lipids and MMP-9 in ApoE -/- mice and the expression of MMP-9 in aortic atherosclerotic plaque are reduced by Baicalin, which it shows has regulation function on stability of the plaque．

Arteriosclerosis Triglycerides @Scutellaria baicalensis Animals,laboratory Mice

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81025002)

動(dòng)脈硬化 甘油三酯類(lèi) @黃芩苷 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 小鼠

R543

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.001

△西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科

▲陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科

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