反相高效液相色譜法測定桂枝馬錢片中士的寧和馬錢子堿的含量

婁玉霞

【摘 要】目的：采用反相高效液相色譜法測定桂枝馬錢片中士的寧和馬錢子堿含量。方法：色譜柱為Hypsil Gold C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈- 0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.02 mol·L-1

磷酸二氫鉀等量混合溶液（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8）（21∶79），檢測波長為260 nm，

柱溫為30 ℃，流速為1 mL·min-1。結(jié)果：士的寧進(jìn)樣量在13.60～68.00 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.999 9），平均加樣回收率97.08%，RSD為1.63%（n = 6）；馬錢子堿進(jìn)樣量在10.92～54.60 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.999 9），平均加樣回收率為96.78%，RSD為1.80%（n = 6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于桂枝馬錢片的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 桂枝馬錢片；士的寧；馬錢子堿；反相高效液相色譜法

Determination of the Contents of Strychnine and Brucine in Guizhi Maqian Tablets（桂枝馬錢片）

with RP-HPLC

LOU Yu-xia

【ABSTRACT】Objective：To determinate the contents of strychnine and Brucine in Guizhi Maqian Tablets

（桂枝馬錢片）with RP-HPLC（reversed phase high-performance liquid chromatography）.Methods：The chromatographic

column was Hypsil Gold C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）.The mobile phase was the balanced mix of acetonitrile-sodium heptanesulfonate（0.01 mol·L-1）and potassium dihydrogen phosphate（0.02 mol·L-1）（Phosphoric acid with 10% mass fraction was used to adjust the pH value to 2.8）（21∶79）.The detection wavelength was 260 nm，the column temperature was 30℃，and the flow rate was 1 mL·min-1.Results：The sample size of strychnine within 13.60～68.00 μg·mL-1 showed a good linear relationship（r = 0.999 9） with its peak area.The average recovery rate was 97.08% and the RSD was 1.63%（n = 6）.The sample size of brucine within 10.92～54.60 μg·mL-1 showed a good linear relationship（r = 0.999 9）with its peak area.The average recovery was 96.78% and the RSD was 1.80%（n = 6）.Conclusion：The method，with accuracy，good repeatability and high sensitivity，can be used for quality control of Guizhi Maqian Tablets.

【Keywords】 Guizhi Maqian Tablets（桂枝馬錢片）；strychnine；brucine；RP-HPLC

桂枝馬錢片是河南風(fēng)濕病醫(yī)院婁多峰教授的經(jīng)驗(yàn)方，由桂枝、赤芍、制馬錢子、甘草、生姜、大棗等藥物組成，具有溫經(jīng)活血、通絡(luò)止痛的作用，適用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨關(guān)節(jié)炎、肩周炎、腰椎間盤突出癥等疑難風(fēng)濕病出現(xiàn)頑固疼痛者。制馬錢子是處方中的主要藥物，但有較大毒性，過量使用會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)，如驚厥、抽搐、昏迷等。制馬錢子所含的化學(xué)成分士的寧和馬錢子堿既是有效成分，同時(shí)也是毒性成分，用量一定要精準(zhǔn)。本研究在參考《中國藥典》（2015版，

一部）[1]和相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]的基礎(chǔ)上，針對(duì)桂枝馬錢片中士的寧和馬錢子堿2種成分，運(yùn)用RP-HPLC法同時(shí)測定其含量，進(jìn)而可以更好地控制其質(zhì)量，為該藥應(yīng)用于臨床時(shí)的安全性和有效性提供保障。

1 材 料

1.1 儀 器 2695型高效液相色譜儀（美國Waters，Empower工作站，2696 PAD檢測器）；Mettler AE 240 電子天平（瑞士梅特勒公司）；SB-5200DT型超聲波清洗器（寧波新芝有限公司）。

1.2 藥品與試劑 桂枝馬錢片（河南風(fēng)濕病醫(yī)院自制，生產(chǎn)批號(hào)140601、140602、140603，規(guī)格每片0.3 g）；對(duì)照品士的寧和馬錢子堿（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110705-200306，含量97.0%；110706-200505，含量95.9%）；試驗(yàn)用甲醇、乙腈是色譜級(jí)；其余試劑是分析級(jí)；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Hypsil Gold填料的ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國熱電）。流動(dòng)相：乙腈- 0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與 0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀等量混合溶液 （用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（21∶79）。檢測波長：260 nm。流速：1 mL·min-1。色譜柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取馬錢子堿5.46 mg、士的寧6.80 mg，放入50 mL的容量瓶內(nèi)，加入三氯甲烷輕輕搖動(dòng)使其溶解；再用三氯甲烷加到刻度線，搖勻作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精確量取以上儲(chǔ)備液3 mL，放入10 mL量瓶內(nèi)，用甲醇定容，搖勻，即得對(duì)照品混合液（每毫升含有士的寧40.80 μg和馬錢子堿32.76 μg）。

2.2.2 供試品溶液 取桂枝馬錢片20片，充分研細(xì)，混勻，稱取2 g，精確稱定；置磨口錐形瓶中，加氫氧化鈉試液5 mL，搖勻，放置30 min；加三氯甲烷25 mL，放置天平上稱重；在水浴鍋內(nèi)加熱回流2 h，取出后放冷到與室溫相同；用三氯甲烷回補(bǔ)到起始重量，搖勻；在玻璃漏斗上鋪少量的無水硫酸鈉，過濾，不要初濾液；精確量取后面的濾液5 mL，放入10 mL的容量瓶內(nèi)；加甲醇到刻度線，輕輕搖動(dòng)，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取后續(xù)濾液即可。

2.2.3 空白溶液 依照桂枝馬錢片的處方加工工藝，制成空白樣品（缺少制馬錢子），并按2.2.2項(xiàng)

下方法制成空白對(duì)照溶液。

2.3 空白樣品干擾試驗(yàn)（專屬性試驗(yàn)） 精確吸取按2.2項(xiàng)下方法制備的3種溶液各10 μL，按所選定的色譜條件測定，液相色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，分離度 > 1.5，理論塔板數(shù)按成分士的寧的峰進(jìn)行計(jì)算不低于5000，空白溶液在化學(xué)對(duì)照品峰相同保留時(shí)間處沒有出現(xiàn)色譜峰，表明方中其他中藥材和輔料對(duì)目標(biāo)成分的測定沒有干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液1，2，3，4，5 mL，分別放置于5只10 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇到刻度線，輕輕搖動(dòng)，即可。精密吸取上述5種溶液10 μL，進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)：對(duì)照品進(jìn)樣溶液濃度?？v坐標(biāo)：與不同濃度相對(duì)應(yīng)的峰面積）。得出2種成分的回歸方程分別為：士的寧Y = 139 70 X + 120 85（r = 0.999 9），馬錢子Y = 18 220 X + 9287（r = 0.999 9）。結(jié)果表明士的寧進(jìn)樣濃度在13.60～68.00 μg·mL-1、馬錢子堿進(jìn)樣濃度在10.92～54.60 μg·mL-1范圍內(nèi)與相應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度考察 取桂枝馬錢片樣品，制備成供試品溶液，精密吸取10 μL，按選定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果2種成分峰面積的RSD（n = 6），士的寧為1.7%，馬錢子堿為1.9%，證明本研究所用儀器有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在制好后第0， 2，4，8，10，12小時(shí)，按所選定的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果2種成分峰面積的RSD

（n = 6），士的寧為1.5%，馬錢子堿為1.5%，說明供試品溶液制備后12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取桂枝馬錢片（生產(chǎn)批號(hào)140602）20片，研成細(xì)粉，平行取6份，每份約2 g，精確稱定后，制成供試品溶液。按本研究確定的色譜條件測定，并進(jìn)行含量的計(jì)算。結(jié)果2種成分含量的RSD（n = 6），士的寧為0.87%，馬錢子堿為2.21%，證明本研究有良好的重復(fù)性。

2.8 樣品中成分的含量測定 取3個(gè)不同批次的桂枝馬錢片，按照上述方法制備成供試品溶液。在已選定的色譜條件下進(jìn)樣測定。每片含量計(jì)算，結(jié)果見表1。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取桂枝馬錢片細(xì)粉（生產(chǎn)批號(hào)140602，含士的寧0.779 mg·g-1，馬錢子堿

0.965 mg·g-1）6份，每份約3.5 g，精確稱重后，分別置磨口錐形瓶中；每瓶中準(zhǔn)確加入一定量的2種對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備所需溶液；按選定的色譜條件，各吸取6 μL，進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

根據(jù)制備工藝中制馬錢子的加入量進(jìn)行理論值推算，并參考本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暫定每片桂枝馬錢片中制馬錢子以士的寧（C21H22N2O2）計(jì)應(yīng)在0.18～0.35 mg范圍

內(nèi)，以馬錢子堿（C23H26N2O4）計(jì)應(yīng)不少于0.20 mg。

3 討 論

3.1 測定波長的選擇 根據(jù)士的寧和馬錢子成分峰的PAD吸收光譜，并參照《中國藥典》（2015版，一部）馬錢子項(xiàng)下規(guī)定的含量測定方法，選定260 nm

作為本研究色譜方法的檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇 參照《中國藥典》（2015版，一部）方法，采用乙腈- 0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉與0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀等量混合溶液（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8）系統(tǒng)為流動(dòng)相。經(jīng)過試驗(yàn)，當(dāng)兩者比例達(dá)到21∶79時(shí)，能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)的要求。

3.3 提取方法的考察 在參考藥典的基礎(chǔ)上，取樣品，加氫氧化鈉試液放置，用氯仿回流提取制備供試液，進(jìn)樣測定；同時(shí)，曾采用將樣品以石油醚脫脂后同法處理，進(jìn)樣測定，結(jié)果兩者色譜圖基本一致。表明沒有脫脂預(yù)處理樣品的必要，可能是因?yàn)楸酒诽幏捷^精簡，干擾成分較少之故。

4 參考文獻(xiàn)

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收稿日期：2016-06-15；修回日期：2016-08-10