microRNA-137對(duì)人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移侵襲的影響

劉曉陽，鄭海倫，任 志，張 磊

microRNA-137對(duì)人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移侵襲的影響

劉曉陽1，2，鄭海倫2，任 志2，張 磊1

目的研究miR-137過表達(dá)對(duì)人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移侵襲的影響。方法采用RT-PCR法檢測(cè)5株胃癌細(xì)胞和人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES）中miR-137的表達(dá)。構(gòu)建miR-137慢病毒，并轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞。通過劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲小室檢測(cè)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)以分析過表達(dá)miR-137對(duì)MKN-45細(xì)胞遷移侵襲的影響。結(jié)果MKN-45細(xì)胞中miR-137的表達(dá)豐度明顯低于在GES、MKN-74、AGS、SGC-7901和BGC-823細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)成功構(gòu)建micro up病毒感染的細(xì)胞組。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組（CON組）和陰性對(duì)照組（NC組）比較，micro up組24、48 h后平均遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；細(xì)胞侵襲小室檢測(cè)結(jié)果顯示，與CON組、NC組比較，micro up組的平均遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組、NC組比較，micro up組平均遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論miR-137過表達(dá)能明顯抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移侵襲能力，有可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。

胃癌；miR-137；MKN-45；細(xì)胞侵襲

microRNA（miR）是長度約18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，越來越多的研究［1-2］提示miR幾乎參與調(diào)控所有人類已知的細(xì)胞進(jìn)程，在功能上充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。胃癌是人類的常見惡性腫瘤。該研究通過在人胃癌MKN-45細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-137使其過表達(dá)，探討miR-137對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)一步揭示miR-137在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料has-miR-137、永生化正常人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES）、人胃癌細(xì)胞系（AGS、BCG-823、MKN-45、MKN-74、SGC-7901）、Primer（R＆F）購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；Trizol、Opti-MEM購自美國Invitrogen公司；DNTPs、Rnase Inhibitor、MMLV購自美國Promega公司；DMSO購自上海生物試劑廠；Oligo dT購自上海生工公司；SYBR Master Mixture、Real-Time PCR（RT-PCR）儀器購自日本TaKaRa公司；胎牛血清FBS、DMEM購自美國Gibco公司；胰酶購自上?；瘜W(xué)試劑公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；Nanodrop分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；穩(wěn)壓電泳儀購自上海天能公司；熒光顯微鏡購自日本奧林帕斯公司；CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；生物安全柜購自上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 抽提總RNA（根據(jù)Trizol操作說明書進(jìn)行）；逆轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA（根據(jù)MMLV操作說明書進(jìn)行）；按比例配置反應(yīng)體系，兩步法進(jìn)行RT-PCR，并制作熔解曲線；分析ΔCt值（ΔCt＝目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）。PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。

1.2.2 慢病毒感染 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（CON組）、陰性對(duì)照組（NC組）、micro up組。將胃癌細(xì)胞MKN-45復(fù)蘇，用胰酶消化液將生長90%匯合的細(xì)胞進(jìn)行傳代。取處于對(duì)數(shù)生長期的目的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液接種于6孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%，根據(jù)細(xì)胞感染復(fù)數(shù)值，加入適宜量的病毒（LV-hsa-miR-137），觀察細(xì)胞毒性作用，適時(shí)更換培養(yǎng)基。感染3 d后觀察慢病毒報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，熒光率大于80%者，將細(xì)胞分成兩份，一份分于12孔培養(yǎng)板中待長滿后收集細(xì)胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待長滿后收集細(xì)胞用于蛋白提取。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組別，在孔中加入約5×104個(gè)感染后的細(xì)胞。第2天上午換低濃度血清培養(yǎng)基，使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕。使用無血清培養(yǎng)基輕輕漂洗2遍，加入低濃度血清培養(yǎng)基，拍照0 h圖片。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。熒光顯微鏡于24、48 h拍照。根據(jù)劃痕后的圖片，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率（遷移率為不同拍照觀察時(shí)間點(diǎn)遷移距離與“0 h”劃痕區(qū)域?qū)挾戎档谋戎担?，比較差異。

1.2.4 細(xì)胞侵襲小室實(shí)驗(yàn) 從-20℃冰箱中取出所需數(shù)目的小室到新的24孔板中，恢復(fù)到室溫。在小室和下室中各加500 μl、37℃溫育無血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中放置2 h。對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。加750 μl 30%FBS培養(yǎng)基到下室中，加500 μl細(xì)胞懸液到每個(gè)小室中。在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)64 h。去除培養(yǎng)基，移去非侵襲細(xì)胞。將小室浸泡在Gimesa染色液中30 min，在膜的下表面染色侵入細(xì)胞。沖洗晾干小室。給小室整體拍照，顯微鏡拍照膜，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處進(jìn)行光密度（optical density，OD）值檢測(cè)，計(jì)算各組侵襲率，比較差異。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 按實(shí)驗(yàn)分組將3組細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×105／室鋪于一空24孔板中。加600 μl含30%FBS培養(yǎng)基到下室中。用無血清培養(yǎng)基按一定比例稀釋細(xì)胞，加該細(xì)胞懸液100 μl到每個(gè)小室中。將小室轉(zhuǎn)移入含30%FBS培養(yǎng)基的下室中。在組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。去除培養(yǎng)基，移去非轉(zhuǎn)移細(xì)胞。加400 μl染色液到24孔板的空孔中，將小室浸泡在染色液中20 min，在膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞。沖洗晾干后，用顯微鏡拍照膜，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處進(jìn)行OD570值檢測(cè)，計(jì)算遷移率，比較各組差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，組間數(shù)據(jù)資料比較采用成組設(shè)計(jì)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測(cè)hsa-miR-137在MKN-74、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823及GES的表達(dá)情況當(dāng)ΔCt值≤12時(shí)，該細(xì)胞中基因表達(dá)豐度為高；當(dāng)12＜ΔCt值＜16時(shí)，該細(xì)胞中基因表達(dá)豐度為中；當(dāng)ΔCt值≥16時(shí)，該細(xì)胞中基因表達(dá)豐度為低。hsa-miR-137在GES中的表達(dá)豐度為中，在MKN-74、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中的表達(dá)豐度為低，而在MKN-45表達(dá)豐度最低，與GES及其余幾種胃癌細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝358.00，P＜0.05）。故選擇研究hsa-miR-137在MKN-45細(xì)胞中的生物學(xué)功能。見圖2。

2.2 慢病毒感染培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組別加入慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)。感染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。見圖3。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-137對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力影響分別計(jì)算CON組、NC組、micro up組3組細(xì)胞24、48 h的遷移率。結(jié)果顯示，micro up組24 h后平均遷移率（0.27），與CON組（0.38）和NC組（0.37）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.44，P＜0.05）；micro up組48 h后平均遷移率（0.40），與CON組（0.53）和NC組（0.54）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6.54，P＜0.05）。結(jié)果提示，過表達(dá)miR-137對(duì)MKN-45細(xì)胞遷移的能力有抑制作用。見圖4。

2.4 細(xì)胞侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過對(duì)CON組、NC組及micro up組進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)接種時(shí)MTT OD490值、侵襲小室Giemsa染色OD570值及侵襲率。結(jié)果顯示，micro up組的平均遷移率（0.548），與CON組（0.983）和NC組（1.022）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝58.77，P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-137對(duì)于MKN-45細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。見圖5。

2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過檢測(cè)CON組、NC組及micro up組接種時(shí)MTT OD490值、Transwell小室Giemsa染色OD570及Transwell轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示micro up組的平均遷移率（0.250），與CON組（0.488）和NC組（0.492）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝32.02，P＜0.01）。此結(jié)果顯示過表達(dá)miR-137對(duì)MKN-45細(xì)胞遷移的能力有一定抑制作用。見圖6。

3 討論

miR是一類內(nèi)源性非編碼、長度約22個(gè)核苷酸的小RNA，參與生命過程發(fā)育、分化、增殖及凋亡等重要進(jìn)程。根據(jù)生物學(xué)家的統(tǒng)計(jì)推測(cè)，miR調(diào)節(jié)著約60%的人類編碼基因［3］，其中超過50%的miR基因在功能上與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［4］。

我國為胃癌的高發(fā)國家，通過探討研究胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能對(duì)更深入的闡明胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有著重要的意義。有些miR在胃癌中呈低表達(dá)，如miR-182［5］和miR-429［6］等，另外一些miR在胃癌中呈高表達(dá)，如miR-130b［7］和miR-23a［8］等。而隨著研究的深入，miR對(duì)于胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用被進(jìn)一步揭示，如miR-146a在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過下調(diào)SMAD4基因表達(dá)水平促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長［9］。miR-145可抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲［10］。

miR-137是人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)較早，存在很廣泛的一種miR。近期研究顯示，miR-137在很多腫瘤組織中呈低表達(dá)，參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，如miR-137可以抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲［11］，與結(jié)直腸癌的預(yù)后和侵襲密切相關(guān)［12］，還可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖［13］。本研究通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-137在各種胃癌細(xì)胞中的表達(dá)豐度，結(jié)果顯示相對(duì)于GES，miR-137在多種胃癌細(xì)胞（MKN-74、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823）中呈低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而miR-137在MKN-45中表達(dá)豐度最低，與各組胃癌細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-137在多種胃癌細(xì)胞中的低表達(dá)，提示miR-137可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。為了明確miR-137在胃癌轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮的重要作用，進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)慢病毒感染miR-137后，轉(zhuǎn)染的LV-hsa-miR-137在劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲小室實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，micro up組相對(duì)于NC組和CON組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-137對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞的侵襲遷移能力有抑制作用。

很多文獻(xiàn)已驗(yàn)證miR-137的靶基因包括LSDI［14］，Cdc42［15］等，通過在線軟件（TargetScan.org、microRNA.org、miRDB.org）預(yù)測(cè)miR-137靶基因顯示，miR-137還有的很多潛在基因如MMP-2、PTP4A3等與腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移有關(guān)。miR-137可通過對(duì)這些靶基因的調(diào)控來影響胃癌細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞學(xué)功能。

探索miR-137如何參與及調(diào)控胃癌細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)功能，對(duì)于胃癌早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)及治療均具有重要意義。本研究結(jié)果提示，胃癌細(xì)胞中miR-137基因的低表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲作用，miR-137可能成為胃癌診斷的新指標(biāo)，成為胃癌基因治療的新靶點(diǎn)。

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Effect of microRNA-137 on migration and invasion of MKN-45 cells of human gastric cancer

Liu Xiaoyang1，2，Zheng Hailun2，Ren Zhi2，et al（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 233022；2Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003）

ObjectiveTo study the effectiveness of over expression of miR-137 on migration and invasion of human gastric cancer MKN-45 cells.MethodsRT-PCR technique was explored to detect the expression of miR-137 of 5 strain of gastric cancer cell and human gastric epithelium.Constructed lentivirus vector of overexpressing miR-137.Scratch test，cell invasion chamber test and Transwell invasive test were used to analyze the effectiveness of overexpression of miR-137 on migration and invasion of human gastric cancer MKN-45 cells.ResultsThe degree of expression of miR-137 in MKN-45 was obviously lower than those in GES，MKN-74，AGS，SGC-7901 and BGC-823 cells and the difference was significant（P＜0.05）.The lentivirus vector of micro up miR-137 infected cells group was successfully built.Scratch test result showed that the average migration rates after 24，48 h of micro up group compared with CON group and NC group，the difference was significant（P＜0.05）.The Results of cell invasion chamber test and Transwell invasive test all showed that the average metastatic rates of micro up group compared with CON group and NC group，the difference was significant（P＜0.01）.ConclusionMicro up miR-137 could inhibit distinctively the ability of migration and invasion of human MKN-45 cell strain and might be a novel target point for treatment of gastric cancer.

gastric cancer；miR-137；MKN-45；invasion

R 735.2

A

1000-1492（2015）12-1748-05

時(shí)間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.018.html

2015-09-08接收

安徽高等學(xué)院省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2012B103）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230022

2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，蚌埠 233003

劉曉陽，男，主治醫(yī)師；

張 磊，女，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師；責(zé)任作者；E-mail：chinazhanglei＠163.com