FSCN1與釕配合物在抗胃癌中的作用及相關(guān)性研究

張 敏，徐元宏，董兵斌，盧 敏，陳 鶴

FSCN1與釕配合物在抗胃癌中的作用及相關(guān)性研究

張 敏1，徐元宏1，董兵斌2，盧 敏1，陳 鶴1

目的探討FSCN1在胃癌增殖中的作用，并研究FSCN1與釕配合物在胃癌中的相互作用。方法通過熒光定量PCR及Western blot法檢測胃癌組織中FSCN1的表達(dá)水平；MTT、EdU法檢測干擾FSCN1后細(xì)胞增殖能力變化；用釕配合物處理SGC-7901后檢測FSCN1 mRNA、蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞的增殖能力；siRNA抑制FSCN1的表達(dá)，過表達(dá)FSCN1后檢測釕配合物對細(xì)胞的增殖能力影響。結(jié)果熒光定量PCR及Western blot法均顯示胃癌組織中FSCN1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織；MTT與EdU法結(jié)果顯示，與siNC組比較，干擾FSCN1后細(xì)胞的增殖受到明顯抑制（P＜0.01）；釕配合物處理SGC-7901后，定量PCR結(jié)果顯示，與siNC組比較，F(xiàn)SCN1表達(dá)水平受到抑制（P＜0.01），MTT法結(jié)果顯示，與siNC組比較，細(xì)胞增殖受到抑制（P＜0.01）；MMT法結(jié)果顯示過表達(dá)FSCN1后抑制釕配合物對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)論FSCN1具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的能力，釕配合物通過抑制FSCN1的表達(dá)起抑癌作用。

FSCN1；胃癌；釕配合物；SGC-7901

胃癌是目前全球常見的人類消化道惡性腫瘤之一，其分子機(jī)制仍未被完全解釋清楚。因此明確胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對于提高胃癌的診斷、治療及預(yù)后都有重要的意義。Fascin-1（FSCN1）是相對分子量為55 ku的細(xì)胞骨架蛋白，其能通過聚合肌動蛋白催化其成束而改變細(xì)胞骨架，使細(xì)胞膜表面突起增多，從而增加上皮細(xì)胞的運(yùn)動性［1］。在人體正常組織中FSCN1表達(dá)相對較少，而在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)［2-3］。FSCN1蛋白在胃癌中表達(dá)高于癌旁組織（距離癌組織＞2 cm），F(xiàn)SCN1的表達(dá)量與胃癌體積、侵襲程度、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分型呈正相關(guān)性［4-5］。已有大量文獻(xiàn)［2-5］報道FSCN1對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響，但對腫瘤增殖的作用機(jī)制研究未見報道。該研究檢測了胃癌組織中FSCN1 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平，探討FSCN1在胃癌增殖中的作用，并研究FSCN1與釕配合物在胃癌中的相互作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及組織來源人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。從安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集20例胃癌組織及其配對的癌旁組織（距離癌組織＞2 cm）。所有樣品液氮冷凍后存放于-80℃冰箱。該研究獲得患者及其家屬知情同意和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器TRIzol、Lipofectamine?

2000、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、青霉素／鏈霉素購自美國Life Technologies公司；FSCN1抗體（MAB3582）和PVDF膜購自德國Millipore公司；Ligation high Ver.2反轉(zhuǎn)錄試劑購自日本東洋紡公司；siRNA、MTT購自美國Sigma公司；定量試劑購自美國KAPA公司；Cell-LightTMEdU Apollo?488 In Vitro Imaging Kit購自廣州銳博公司；PMSF、BCA蛋白定量試劑購自上海碧云天公司；Cocktail Protease Inhibitor購自美國Roche公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GC Buffer、EcoRⅠ、BamHⅠ購自日本TaKaRa公司；引物由上海英俊公司合成。Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System、NanoDrop 2000購自美國Thermo Scientific公司；Odyssey蛋白印跡成像系統(tǒng)購自中國LI-COR公司；DMI3000 B型倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SGC-7901用含10%FBS和1%青霉素／鏈霉素的RPMI-1640在37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。使用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染siRNA、FSCN1過表達(dá)質(zhì)粒，具體操作參考說明書。6孔板中每孔siRNA終濃度為50 nmol／L，質(zhì)粒每孔為4 μg。轉(zhuǎn)染siNC為siNC組，轉(zhuǎn)染siFSCN1為siFSCN1組，轉(zhuǎn)染過表達(dá)空載質(zhì)粒為NC組，轉(zhuǎn)染FSCN1過表達(dá)質(zhì)粒為FSCN1組。

1.3.2 釕配合物處理細(xì)胞 使用濃度為7.865 μmol／L的釕配合物L(fēng)203進(jìn)行對細(xì)胞的給藥處理48 h，記為L203組。

1.3.3 Western blot法檢測 用含有1×cocktail及1 mmol／L PMSF的RIPA強(qiáng)裂解液冰上裂解30 min提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，取60 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1 h，并用FSCN1抗體結(jié)合，PBST洗脫3遍后用帶熒光標(biāo)記的二抗孵育并掃膜拍照，以β-actin作為內(nèi)參。

1.3.4 RNA抽提及實(shí)時定量PCR 用TRIzol試劑提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FSQ-301說明書以10 μl體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量。FSCN1上游引物：5’-ACAGCAGGGGACTCAG-3’，下游引物：5’-CCCACCGTCCAGTATTT-3’。18S上游引物：5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’，下游引物：5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性3 s，60℃退水30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析。

1.3.5 FSCN1過表達(dá)載體構(gòu)建 從人cDNA中擴(kuò)增出FSCN1（NM_003088.3）完整CDS區(qū)，經(jīng)過EcoRⅠ／BamHⅠ酶切后，連接到pcDNA3.1（-）載體中。轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆。經(jīng)過PCR、酶切鑒定后進(jìn)行測序。上游引物序列為：5′-TAAGAATTCCGCGCAGCGGCCTCTCGTCTAC-3′；下游引物序列為：5′-TAAGGATCCGTTAGCAGGGAGGGTTGGCAGGAGC-3′。

1.3.6 MTT實(shí)驗(yàn) SGC-7901經(jīng)過處理后接種1 000個／200 μl到96孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。在1、3、4、5 d每孔加MTT溶液（5 mg／ml用PBS配）20 μl。繼續(xù)孵育4～6 h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO充分溶解，在450 nm處測定吸光度（optical density）值，計算3個重復(fù)孔的平均OD值。按以下公式計算細(xì)胞的生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率（%）＝（OD對照組-OD實(shí)驗(yàn)組）／OD對照組×100%。繪制不同藥物濃度的細(xì)胞生長抑制率曲線，并計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.7 EdU實(shí)驗(yàn) 將處理后的細(xì)胞用胰酶消化，按1×104個細(xì)胞／孔加入到96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，每孔中加入50 μmol／L的EdU稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄反應(yīng)液，PBS清洗細(xì)胞2次，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，每孔加入50 μl、2 mg／ml甘氨酸搖床孵育5 min，PBS洗3次。最后分別用Apollo?488染色反應(yīng)液和Hoechst 33342染色30 min，期間用含0.5%TritonX-100的PBS洗3次。在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，所有計量資料采用形式表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，組間差異比較采用方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 FSCN1在胃癌組織中的表達(dá)相比于癌旁組織，在胃癌組織中有60%（12例）樣本FSCN1 mRNA的表達(dá)水平顯著增高，15%樣本中FSCN1 mRNA表達(dá)水平無顯著差異，25%的樣本中FSCN1 mRNA表達(dá)水平降低（圖1A）。隨后，提取其中9例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織的總蛋白進(jìn)行Western blot法檢測，與癌旁組織相比有6例樣品的胃癌組織中FSCN1蛋白表達(dá)水平明顯上升（圖1B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，F(xiàn)SCN1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。

2.2 通過siRNA下調(diào)胃癌細(xì)胞中FSCN1的表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響FSCN1siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901，48 h后通過Western blot法驗(yàn)證siFSCN1可以降低FSCN1表達(dá)水平，并且下調(diào)FSCN1后能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖（圖2A、2B）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到相同的結(jié)論，轉(zhuǎn)染了siNC的SGC-7901細(xì)胞均有50%以上能被EdU標(biāo)記，而siFSCN1組被EdU標(biāo)記的細(xì)胞均少于25%，其數(shù)值分別為（51±4.3）%、（22±2.7）%（P＝0.001 6）。相比siNC組，siFSCN1組DNA的復(fù)制活性顯著降低，即細(xì)胞增殖能力顯著降低（圖2C）。

2.3 L203通過降低FSCN1表達(dá)水平對細(xì)胞增殖的影響按上述處理24 h后顯示細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，測得IC50為7.865 μmol／L（圖3A、3B）。同時，MTT實(shí)驗(yàn)顯示L203組相對于NC組，SGC-7901的增殖明顯受到抑制（P＝0.002 8），見圖3C。為了進(jìn)一步證明L203是通過影響FSCN1的表達(dá)水平來發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖作用，在L203藥物處理48 h后分別用qRT-PCR和Western blot法檢測FSCN1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示L203處理組FSCN1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較NC組均降低50%以上（圖3D、3E）。

2.4 過表達(dá)FSCN1對L203的抑癌作用的影響MTT結(jié)果顯示SGC-7901中過表達(dá)FSCN1可以顯著促進(jìn)L203處理過的細(xì)胞的增殖（P＝0.003 5），但細(xì)胞增殖速度仍低于NC組（圖4A）；EdU結(jié)果顯示FSCN1可以顯著促進(jìn)L203處理過的細(xì)胞的增殖（P＝0.002 8），但細(xì)胞增殖速度仍低于NC組（圖4B）。

3 討論

FSCN1在細(xì)胞遷移、運(yùn)動、黏附和細(xì)胞相互作用等方面具有重要的作用，并且FSCN1作為原癌基因在多種腫瘤細(xì)胞中通過增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力促進(jìn)腫瘤的形成［3］。在胃癌組織中FSCN1蛋白表達(dá)與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和TNM分型呈正相關(guān)性。研究［6］顯示在胃癌細(xì)胞MKN45中敲減FSCN1的表達(dá)會抑制細(xì)胞的增殖和遷移。本研究檢測了FSCN1在胃癌組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)水平，顯示FSCN1在胃癌組織中高表達(dá)。在SGC-7901中下調(diào)FSCN1表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

化療是目前臨床治療癌癥的三大手段之一，鉑類藥物是目前治療癌癥的常用藥物，但這些藥物副作用大、容易產(chǎn)生耐藥性等使其臨床應(yīng)用受限［7］。釕配合物作為一類低毒高效的金屬基抗腫瘤化合物，與順鉑等相比具有更復(fù)雜的作用機(jī)制及較低的毒副作用而成為研究的熱點(diǎn)［8］。目前釕配合物的抗癌機(jī)制研究主要集中在以下幾個方面：與單個堿基作用；與蛋白和多肽作用；與DNA作用［9］。釕配合物作為當(dāng)前非鉑類抗癌藥物的研究熱點(diǎn)，有文獻(xiàn)［10］報道其可以抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖。對于釕配合物與DNA及單個堿基的相互作用機(jī)制已研究比較透徹，但對于其他的靶向作用機(jī)制尚不清楚，這極大地制約了釕的臨床應(yīng)用［8］。本研究顯示SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過釕配合物L(fēng)203作用后細(xì)胞增殖能力受到抑制，IC50為7.865 μmol／L。SGC-7901經(jīng)L203處理后FSCN1的mRNA和蛋白表達(dá)水平都比未加藥物處理組明顯降低。

通過L203處理細(xì)胞后過表達(dá)FSCN1質(zhì)粒，MTT及EdU實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)FSCN1的過表達(dá)可以降低釕配合物的抑癌作用。該研究成果為確認(rèn)釕配合物的蛋白作用靶點(diǎn)提供了依據(jù)。釕配合物的抑癌作用還需要進(jìn)一步研究。

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Ru complex as tumor inhibitor by regulating FSCN1 in gastric cancer cells

Zhang Min1，Xu Yuanhong1，Dong Bingbin2，et al（1Dept of Clinical Laboratory，2Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the role of FSCN1 in the proliferation of gastric cancer and the interaction between FSCN1 and Ru complex in gastric cancer.MethodsThe expression level of FSCN1 was measured by qRTPCR and Western blot.The proliferation ability was tested using MTT and EdU assays.Then the mRNA and protein levels of FSCN1 in SGC-7901 cells were measured after treating with Ru complex.FSCN1 were transfected into cells，and the proliferation ability was tested using MTT and EdU assays after treating with Ru complex.ResultsThe expression level of FSCN1 in gastric cancer tissues was higher than that in adjacent tissues.Knockdown of FSCN1 in SGC-7901 cells inhibited cell proliferation.The proliferation ability and the expression level of FSCN1 in SGC-7901 cells were decreased after treating with Ru complex.And overexpression of FSCN1 reversed the antitumor effect of Ru complex.ConclusionFSCN1 as the oncogene can regulate gastric cancer proliferation，and Ru complex reverses the course by inhibiting FSCN1 expression.

FSCN1；gastric cancer；Ru complex；SGC-7901

R 735.2

A

1000-1492（2015）12-1744-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.016.html

2015-09-30接收

安徽省年度重點(diǎn)科研計劃項(xiàng)目（編號：1301043022）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1檢驗(yàn)科、2普通外科，合肥 230022

張 敏，女，副主任技師；徐元宏，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xyhong1964＠163.com