喬松素預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

周 甄，馬夢晴，林先和，劉和俊

喬松素預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

周 甄1，馬夢晴1，林先和2，劉和俊2

目的探討不同濃度的喬松素預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷（IRI）的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法成年SD大鼠125只，45只用于前期篩選喬松素適宜用藥濃度，另80只隨機(jī)均分為假手術(shù)組，模型組，喬松素低、中、高劑量（3、10、30 mg／kg）組。通過結(jié)扎大鼠心左冠狀動脈前降支30 min并解開結(jié)扎線釋放血流2 h建立大鼠在體IRI模型，喬松素組于缺血前1 h尾靜脈給藥，模型建立后HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變；免疫熒光染色法檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)及定位；TUNEL原位標(biāo)記凋亡心肌細(xì)胞；Western blot法檢測凋亡蛋白Bax、Caspase-3及自噬蛋白LC3、p62的表達(dá)。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，合適濃度的喬松素能有效改善心肌組織病理學(xué)改變，且呈劑量依賴性，但劑量較高時可能具有毒性作用；免疫熒光染色顯示喬松素組LC3表達(dá)明顯較模型組增多，在胞質(zhì)中廣泛表達(dá)，且呈劑量依賴性；TUNEL染色結(jié)果顯示，喬松素組與模型組比較，凋亡細(xì)胞均明顯減少，且高劑量組優(yōu)于中、低劑量組；Western blot結(jié)果顯示，喬松素組Bax、Caspase-3、p62蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低（P＜0.05），且高劑量組效果更佳（P＜0.01）；喬松素組LC3表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05），且高劑量組增高優(yōu)于中、低劑量組（P＜0.01）。結(jié)論喬松素預(yù)處理對大鼠心肌IRI有保護(hù)作用，其主要作用機(jī)制可能與減少細(xì)胞凋亡和激活自噬有關(guān)。

喬松素；心肌缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；自噬

冠心病是一種常見心血管疾病，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈介入、冠狀動脈旁路移植等再灌注療法取得了良好的治療效果，但針對治療中出現(xiàn)的心肌缺血再灌注損傷（ischemia／reperfusion injury，IRI）卻沒有理想的預(yù)防和治療方法［1］，其損傷機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡、氧自由基過多、鈣超載、炎癥反應(yīng)等有關(guān)［2］。喬松素是一種存在于植物和蜂膠中的含量較高的黃酮類天然化合物，具有抗菌、抗原蟲、抗誘變、抗氧化、抗凋亡等多種藥理學(xué)活性［3］。研究［4］證實(shí)在大鼠腦IRI模型中，喬松素參與抑制凋亡和激活自噬拮抗IRI，但對于心肌IRI是否有效尚未見報道。該研究通過建立大鼠心肌IRI模型，以細(xì)胞凋亡和自噬為研究對象，研究喬松素預(yù)處理對大鼠心肌IRI的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑喬松素購自北京萊耀生物公司（產(chǎn)品編號：LY0734）；熒光二抗、HRP-羊抗小鼠IgG、DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；鼠源抗鼠p62、Caspase-3、Bax抗體均購自美國Abcam公司；LC3-B購自德國Sigma公司；鼠源抗鼠GAPDH、TUNEL染色試劑盒購自南京凱基生物公司；兔抗actin抗體購自武漢博士德生物公司；ECL發(fā)光試劑盒、BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物125只成年健康雄性SD大鼠，SPF級，重200～250 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 動物模型制備及給藥方案125只大鼠中將45只均分為9組，分別為假手術(shù)組、IRI組（模型組）、喬松素（1、3、10、20、30、40、50 mg／kg）組。用藥組濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-5］設(shè)置，用于前期篩選喬松素合適的用藥劑量。剩余80只隨機(jī)均分為5組，分別為假手術(shù)組，模型組，喬松素低、中、高劑量（3、10、30 mg／kg）組。其中8只用于Western blot法檢測，另外8只用于免疫熒光檢測。給藥方案：喬松素組于缺血再灌注前1 h尾靜脈給藥。喬松素粉劑使用DMSO溶解后生理鹽水稀釋配置相應(yīng)濃度藥物；其余各組給予等量生理鹽水。模型制備：5%戊巴比妥鈉40 mg／kg腹腔麻醉大鼠后，經(jīng)口腔氣管插管，接HX300小動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），調(diào)整呼吸頻率75次／min，潮氣量6 ml。于大鼠四肢皮下插入電極連接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠心電圖變化。在大鼠左胸第3、4肋間處通過2～2.5 cm切口長度逐步鈍性分離打開胸腔暴露心臟。于左心耳下方1～2 mm處使用6-0縫線結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支30 min并解開結(jié)扎線釋放血流2 h建立大鼠在體IRI模型。缺血模型建立成功標(biāo)志：結(jié)扎線下心肌組織發(fā)白，心電圖顯示ST段明顯抬高。再灌注成功標(biāo)志：心肌局部充血，ST段逐漸下降。造模結(jié)束后，處死大鼠摘取心臟稱重后于平行房室環(huán)水平處橫切，HE染色標(biāo)本放置于4%福爾馬林溶液中，其余心肌組織放入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱進(jìn)行長期保存。

1.4 檢測指標(biāo)和方法

1.4.1 心肌組織形態(tài)學(xué)HE染色 取左心室前壁心肌組織，制作石蠟切塊，切片后脫蠟行HE染色，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.4.2 免疫熒光染色檢測LC3蛋白表達(dá) 將冰凍組織從-80℃冰箱中取出，OCT包埋組織，冰凍，制備冰凍組織切片（厚約3 μm）。切片在室溫下晾干1 h，冷丙酮固定10 min晾干后置于切片盒中-20℃冰箱保存。取出切片，PBS洗滌3次，每次3 min，1%小牛血清室溫封閉15 min，同時加入LC3和actin抗體（稀釋濃度均為1∶1 000），4℃冰箱過夜。次日孵育熒光二抗，DAPI復(fù)染1 min，蒸餾水沖洗后烘干，抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察。

1.4.3 TUNEL原位標(biāo)記法檢測心肌凋亡細(xì)胞 冰凍切片按照TUNEL試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察。

1.4.4 Western blot法檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 取100 mg心肌組織，加入1 ml裂解液（含100 mmol／L PMSF 10 μl，蛋白酶抑制劑10 μl）后，用2 ml組織勻漿器勻漿數(shù)次后，置于冰上5 min，重復(fù)若干次，待組織勻漿充分后，用移液管將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測，各組上清液用裂解液調(diào)至相同蛋白濃度，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，PVDF膜用含50 g／L脫脂奶粉的TBST室溫封閉3 h。然后依次滴加1∶1 000的鼠抗p62、抗Caspase-3、抗Bax、抗LC3和GAPDH抗體，4℃孵育過夜后TBST洗滌5次，每次5 min，使用1∶10 000山羊抗鼠二抗孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min。最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)拍照，并用Image-J軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示。多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 喬松素預(yù)處理對心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響各組心肌組織HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，胞膜完整，界限清晰，胞質(zhì)染色均勻；模型組及喬松素1 mg／kg組心肌細(xì)胞排列不齊，界限不清，胞質(zhì)腫脹，染色不均，有炎性細(xì)胞浸潤，肌纖維溶解，部分細(xì)胞空泡變性；喬松素3 mg／kg組心肌細(xì)胞排列不齊，界限不清，胞質(zhì)腫脹，染色不均，有炎性細(xì)胞浸潤，空泡變性較模型組減輕；喬松素10 mg／kg組心肌細(xì)胞排列較不齊，界限較清晰，胞質(zhì)染色稍不均，少量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞水腫不明顯；喬松素20、30 mg／kg組細(xì)胞排列較整齊，界限較清晰，胞質(zhì)染色較均勻，僅有部分心肌纖維波紋樣改變；喬松素40、50 mg／kg組心肌細(xì)胞排列不齊，界限較不清，胞質(zhì)較腫脹，有少量炎性細(xì)胞浸潤，可能與藥物本身毒性有關(guān)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題分別設(shè)置喬松素3、10、30 mg／kg為喬松素低、中、高劑量組進(jìn)行進(jìn)一步機(jī)制研究，其中30 mg／kg為最佳用藥劑量，見圖1。

2.2 自噬標(biāo)志蛋白LC3免疫熒光染色結(jié)果喬松素組LC3蛋白表達(dá)明顯較模型組增多，廣泛在胞質(zhì)中表達(dá)，呈劑量依賴性，假手術(shù)組幾乎無表達(dá)。LC3表達(dá)的心肌細(xì)胞為黃色（心肌actin蛋白綠色熒光和LC3蛋白橙色熒光疊加效果），如圖2箭頭所示。提示喬松素預(yù)處理能明顯增加大鼠心肌IRI時細(xì)胞自噬水平。

2.3 TUNEL染色結(jié)果喬松素組凋亡細(xì)胞明顯較模型組減少，且高劑量組效果更佳。凋亡后的心肌細(xì)胞染色為綠色，如圖3箭頭所示。提示喬松素預(yù)處理可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕大鼠心肌IRI。

2.4 喬松素預(yù)處理對大鼠心肌凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與模型組比較，喬松素組凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3表達(dá)均明顯減少（P＜0.05），其中，喬松素高劑量組相對于低、中劑量組減少更明顯（P＜0.01），表明喬松素預(yù)處理能明顯減輕大鼠心肌IRI時細(xì)胞凋亡的發(fā)生，與TUNEL染色結(jié)果一致，見圖4。

2.5 喬松素預(yù)處理對大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與模型組比較，喬松素組自噬蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)均明顯增多（P＜0.05），其中，喬松素高劑量組LC3-Ⅱ表達(dá)量相對于低、中劑量組增加更明顯（P＜0.01）；與模型組比較，喬松素組自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），其中喬松素高劑量組p62表達(dá)量相對于低、中劑量組減少更明顯（P＜0.01）。表明喬松素預(yù)處理能明顯激活并增加大鼠心肌IRI時細(xì)胞自噬水平，與免疫熒光染色結(jié)果一致，見圖5。

3 討論

心肌IRI是導(dǎo)致心律失常、心肌梗死、慢性心力衰竭難以逆轉(zhuǎn)的最主要、最常見的病理損傷，如何有效預(yù)防其發(fā)生已成為心血管系統(tǒng)面臨的重要難題。研究［3］表明，喬松素在大鼠全腦缺血模型中，能夠有效改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分，減少神經(jīng)元死亡和梗死面積，提高大鼠存活率，并通過提高線粒體內(nèi)ATP的生成，有效保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)，減少活性氧生成，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞拮抗IRI。研究［6］還證實(shí)了喬松素能夠通過保護(hù)大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少腦水腫和血腦屏障通透性，以及減輕血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的病理改變抵抗全腦IRI。本實(shí)驗(yàn)顯示喬松素能有效改善并減輕心肌IRI病理學(xué)損傷，并在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，但濃度過高時可能會因其藥物毒性而加重?fù)p傷發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)最佳用藥劑量為30 mg／kg尾靜脈給藥。TUNEL染色結(jié)果顯示喬松素組心肌凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯少于模型組；Western blot結(jié)果也進(jìn)一步提示喬松素組的凋亡蛋白Bax和 Caspase-3表達(dá)水平均明顯低于模型組，且高劑量組效果更佳，表明喬松素可能通過抑制細(xì)胞凋亡拮抗心肌IRI。

過去認(rèn)為心肌細(xì)胞丟失的機(jī)制主要涉及心肌細(xì)胞的壞死與凋亡，近年來，隨著對細(xì)胞死亡方式的更深層次的理解和探究，另一種細(xì)胞死亡方式-自噬，也參與該過程，其是細(xì)胞降解損傷的細(xì)胞器和多余蛋白質(zhì)等物質(zhì)的主要途徑［7］。喬松素已被證實(shí)在腦IRI大鼠模型中能有效提高大鼠行為學(xué)評分，減輕腦水腫及腦梗死面積，其保護(hù)機(jī)制可能與抑制凋亡和激活細(xì)胞自噬有關(guān)［4］。本實(shí)驗(yàn)中喬松素組的自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)明顯高于模型組，p62明顯低于模型組，并且呈劑量依賴性。免疫熒光染色提示喬松素組LC3蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組和假手術(shù)組，表明喬松素能有效激活細(xì)胞自噬，并呈劑量依賴性，提示可能通過激活自噬參與拮抗心肌IRI，推測可能與改善能量平衡代謝障礙、清除代謝廢物、減少氧自由基形成及參與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ 潘國焰，林 榮.心肌缺血／再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（8）：1368-72.

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The protective effect of pinocembrin pre-conditioning on rats after myocardial ischemic-reperfusion injury

Zhou Zhen1，Ma Mengqing1，Lin Xianhe2，et al
（1The Second Clinical Medical College of Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the protective effect and its mechanism of pinocembrin pre-conditioning on rats after myocardial ischemic-reperfusion injury（IRI）.Methods45 male sprague-dawley rats were used for exploring the suitable concentration of the pinocembrin and 80 rats were equally divided into 5 groups：sham group，model group，low，middle，high dose（3，10，30 mg／kg）group.The IRI models were set up by ligating rat＇s left anterior descending coronary artery for 30 minutes then loosing it for 2 hours.Pinocembrin was gave 1 hour via tail intravenous injection before ischemic-reperfusion.The morphological changes of myocardial tissues were observed by HE staining.The LC3 expression and position were measured by immunofluorescence.The apoptosis of myocardial cells was measured by TUNEL staining.The expression of apoptosis-related protein such as Bax，Caspase-3，p62 and autophagy-related protein，LC3 were detected by Western blot.ResultsHE staining showed that the pathological changes of myocardial tissues were improved by pinocembrin and presented a dose-dependence.However，high-dose of drug might bring the drug toxicity.The expression of LC3 was more in the test group than the model group as evidenced by immunofluorescence staining and in a dose dependent fashion.Compared with the model group，the TUNEL-labeled myocardial cells were significantly decreased in pinocembrin groups，and the level of apoptotic cells were negatively related to the pinocembrin concentration.Western blotResultsshowed that Bax，Caspase-3 and p62 in pinocembrin groups were significantly lower than in model group.The levels of apoptotic proteins were negatively related to the pinocembrin concentration.In reverse，compared with the model group，the autophagic-related protein，LC3，showed an increasing trend in the pinocembrin groups and presented a positive relation to drug’s concentration.ConclusionTheResultsindicate that the pinocembrin pre-conditioning shows the protective effect on rats after myocardial IRI.The mainly protective mechanisms are possibly related to the inhibition of apoptosis and activation of autophagy.

pinocembrin；myocardial ischemic-reperfusion；cell apoptosis；autophagy

R 542.2；R 932

A

1000-1492（2015）12-1729-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.010.html

2015-07-07接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1508085MH145）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022

周 甄，女，碩士研究生；

劉和俊，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：1981806821＠qq.com