利用正交試驗法優(yōu)選復(fù)合中草藥提取物

陳恩保 劉文利 （山東省齊河縣畜牧獸醫(yī)局 251100）

由于環(huán)境中各種致病因素尤其是免疫抑制性致病因素的存在，嚴(yán)重影響了家禽機體的免疫功能和對疫苗的免疫應(yīng)答效果，使得傳染性疾病的防治變得非常困難。因此，預(yù)防傳染性疾病的發(fā)生僅靠疫苗是不夠的，需要采取包括增強機體免疫力在內(nèi)的綜合防制手段。而免疫增強劑正是通過非特異性途徑來增強機體后天獲得的非特異性和特異性免疫機能，這可能是解決該項難題的一條重要途徑。為此，從益氣、補血、滋陰、壯陽四個方面著手，精心篩選出硫酸修飾化黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖這四種分別具有此項功能的多糖組成復(fù)合制劑，以此復(fù)合制劑作為免疫增強劑，為了搞清這四種組分在整個組方中所起的作用以及各組分間的最佳用藥配比，筆者以T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率為指標(biāo)，應(yīng)用正交試驗法進行了研究分析。

1 材料與方法

1.1 試驗用藥物 黃芪多糖、淫羊藿多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖，全部購自北京市藥材公司，經(jīng)含量測定分別為89.1%、73.7%、(苯酚—硫酸法)。

1.2 試驗用雞 商品海蘭白蛋雞，10日齡健康雛雞。

1.3 正交試驗設(shè)計 本試驗采用L9(34)正交表進行設(shè)計[1,2]，將硫酸修飾化黃芪多糖(A)、當(dāng)歸多糖(B)、枸杞多糖(C)及淫羊藿多糖(D)作為4個試驗因素，每個因素3個水平，各因素水平詳見表1。

1.4 試驗方法 按L9(34)正交表提供的配方設(shè)計9個試驗組，另設(shè)一個空白對照組。具體方法是選擇11日齡、體重相近的健康雛雞100只，隨機分為10組，每組10只，1-9組分別為按L9(34)正交表提供的9個不同配方的用藥組，第10組為空白對照組即不用藥組，連用5d后，分別在16日齡和21日齡抽取各組雞5只，進行T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率試驗。具體正交試驗方案見表2。

1.5 T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的測定 按照參考文獻(xiàn)[3]進行檢測。

表1 因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果

表2 L9(34)正交試驗方案及試驗結(jié)果(±SD)

表2 L9(34)正交試驗方案及試驗結(jié)果(±SD)

處理號 因素 T淋巴細(xì)胞 ANAE陽性率% B淋巴細(xì)胞 EAC花環(huán)率% A B C D 1 1 1 1 1 33.5±1.6 35.2±2.6 22.0±3.2 28.5±3.6 2 1 2 2 2 38.2±1.5 39.0±1.4 21.6±2.7 24.2±3.0 3 1 3 3 3 34.5±2.5 35.3±3.2 20.4±1.2 23.9±3.3 4 2 1 2 3 36.1±1.7 37.3±2.3 21.0±2.5 23.5±1.8 5 2 2 3 1 32.7±2.8 36.2±1.7 24.4±1.4 27.9±3.2 6 2 3 1 2 29.5±2.4 32.5±1.9 19.2±1.6 22.7±2.9 7 3 1 3 2 34.6±1.7 37.6±2.1 23.4±1.3 27.2±1.8 8 3 2 1 3 36.3±1.9 39.8±1.9 23.4±1.2 29.1±2.2 9 3 3 2 1 34.3±1.7 38.1±1.4 23.5±2.3 29.6±1.7 10 0 0 0 0 25.1±1.5 28.0±2.6 12.0±3.1 17.3±2.4

正交試驗的結(jié)果詳見表2。從表2可以看出，用正交試驗法得到的9組不同的復(fù)合中草藥提取物配方與空白對照組相比，都對T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的提高有不同程度的促進作用，兩者差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。

2.2 正交試驗結(jié)果的直觀分析 T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的極差分析見表3。表3是分別在16日齡和21日齡時檢測的T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率情況。根據(jù)所得極差R的大小順序可知，A因素和B因素對T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率的影響較大，D因素影響最小。

根據(jù)極差R的大小順序可知，A因素和B因素對B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的影響較大，C因素影響最小。

表3 直觀分析結(jié)果

2.3 正交試驗結(jié)果的方差分析

表4 方差分析結(jié)果

（1）因為L9(34)正交表中的4列都已經(jīng)安排因素沒有空列。因此計算誤差平均和，可用因素平方和中最小者作為誤差平方和平均變動的估計值，但df誤必須為無窮大[4]。（2）從方差分析結(jié)果可以看出，A因素和B因素對T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率的影響較大，D因素影響最小。（3）A因素和D因素對B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率的影響極顯著，B因素影響顯著，C因素影響最小。與極差分析的結(jié)果基本一致。

2.4 最優(yōu)配方的篩選 綜合以上結(jié)果可以得出，A因素是影響兩者大小的重要因素，B因素次之，C和D兩因素影響較差。進一步從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，所以該復(fù)合中草藥提取物的最優(yōu)組合為A3B2C1D1。

3 結(jié)論與討論

（1）通過正交試驗及統(tǒng)計分析，得到該復(fù)合中草藥提取物的最優(yōu)組合為黃芪多糖(A)、當(dāng)歸多糖(B)、枸杞多糖(C)及淫羊藿多糖(D)。（2）正交試驗是一種適用于多因素多水平的試驗設(shè)計方法，可以通過全部因素或主要因素、水平的組合試驗，找出各因素、水平間的內(nèi)在組合規(guī)律，達(dá)到與全面組合試驗相似的效果，比較適合于制劑配方的篩選。應(yīng)用正交試驗的方法，分析中藥復(fù)方各組分在整體組方中所起作用的大小以及各組分的最佳用藥劑量，可以避免進行大量的拆方試驗，從而大大縮短了中藥組方研究開發(fā)的時間。但本方法的難點是怎樣將中藥復(fù)方的整體功效綜合為一個量化的指標(biāo)。（3）在家禽體內(nèi)的免疫活性細(xì)胞中，T、B的數(shù)量與機體免疫功能的高低有著非常密切的關(guān)系，兩者數(shù)量的增加反映了機體免疫力的提高，因此，T、B淋巴細(xì)胞的多少是機體全身免疫機能強弱的一個具體表現(xiàn)。本試驗以T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率和B淋巴細(xì)胞EAC花環(huán)率作為整個組方的療效指標(biāo)，基本上全面概括了整個組方的作用。（4）我們從眾多中草藥中，精心篩選出硫酸修飾化黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖這四種益氣、補血、滋陰、壯陽類的中草藥提取物組成復(fù)方制劑，用此復(fù)方制劑作為免疫增強劑來預(yù)防IBD，彌補了人們通常用中藥散劑或單一中藥提取物作為免疫增強劑來使用的缺點，該提取復(fù)合物適合于家禽各種體質(zhì)，又可飲水使用，順應(yīng)當(dāng)前家禽養(yǎng)殖規(guī)?；?、集約化的發(fā)展趨勢，方便省力，可節(jié)約大量人力、物力、財力和時間。中草藥又具有別于其它類免疫增強劑的獨特天然優(yōu)勢，而且它來源廣泛，價格低廉，用此提取復(fù)合物作為免疫增強劑使用，具有重要的實際意義。

[1]莫惠棟.農(nóng)業(yè)試驗統(tǒng)計[m].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1994.

[2]楊進, 陳建.用正交試驗法研制鹽酸洛美殺星滴耳劑[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2001, 20(3): 9-11.

[3]崔治中.獸醫(yī)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)[m].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

[4]于立芬.數(shù)理統(tǒng)計方法[m].上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2005.