幼兔腓骨切除后再生腓骨的功能研究

韋 露，羅高斌，薄占東，周志廣，阮中堅

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨關節(jié)外科，南寧530021）

自體骨被認為是骨移植材料的“金標準”，因為它結合了骨移植材料所需特性：成骨、骨誘導和骨傳導［1］。腓骨移植作為自體骨移植的重要組織來源，已廣泛應用于治療骨不連、關節(jié)融合、修復骨缺損［2－5］。腓骨通過上、下脛腓韌帶及骨間膜與脛骨聯(lián)結在一起形成一個完整的力學結構，參與支撐體質量，維持踝關節(jié)的正常功能。臨床上腓骨作為移植骨源移植后，保留其原有骨膜，使腓骨具有再生能力，對于兒童尤其重要。但是再生的腓骨組織與正常腓骨組織在形態(tài)、功能、生物應力、組織結構上是否存在差異，國內外研究很少。本研究通過建立幼兔腓骨移植的動物模型，觀察移植后再生的腓骨組織與健側腓骨組織在組織形態(tài)、成骨能力及生物應力等方面是否存在差異，為臨床上進行自體腓骨移植提供相關的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑和設備 堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（南京建成生物研究所提供）；乙二胺四乙酸（EDTA，成都化學試劑廠提供）；骨科切片機；島津AGX萬能材料試驗機。

1.1.2 實驗動物 新西蘭小白兔40只（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供），3月齡、體質量2.00～2.45kg、平均（2.2±0.28）kg，雌性未孕產。20只動物隨機分組編號，以右側腓骨為實驗組，左側為對照組。同時為了驗證保留骨膜與否對腓骨1.5cm骨缺損模型愈合的作用，本實驗設置不保留骨膜組，每組實驗動物4只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型

1.2.1.1 麻醉 小白兔仰臥位固定，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液，劑量1mL/kg。

1.2.1.2 切除方法 實驗組：取每只幼兔右側腓骨作為實驗組，常規(guī)消毒，鋪巾。自腓骨頭向下沿外踝作縱行切口，切開皮膚、皮下組織和筋膜后，自比目魚肌與腓骨長短肌之間進入。在腓骨中上將腓骨長短肌、比目魚肌向前后側分離，用骨膜剝離器自下向上剝離腓骨骨膜，使腓骨斜向起始肌纖維連同骨膜一起剝開。在腓骨中段量取約1.5cm長度［6］，一般認為缺損值達到骨直徑的1.5～2.0倍即可認為是缺損臨界值［7］。腓骨近端及遠端用尖嘴咬骨鉗剪斷（注意保護骨膜），取出骨塊（圖1）。仔細止血，依次縫合深筋膜、皮下組織及皮膚。對照組：取每只幼兔左側腓骨，腓骨不切除，作為實驗自身對照。不保留骨膜實驗組：手術步驟基本同切除腓骨，在切取腓骨時不保留骨膜將腓骨及骨膜完整切除。

圖1 術中保留骨膜切取腓骨

1.2.1.3 X線片監(jiān)測腓骨再生的情況 分別于術后15、30、60d同時攝雙側小腿照片，觀察再生腓骨的生長情況及形態(tài)變化，并進行影像學分析。

1.2.1.4 取材 實驗過程中，4只兔子術后出現(xiàn)切口感染、患疥螨等并發(fā)癥，治療未果，死亡，未達到實驗終點，予以剔除。其余兔子于術后60d用3%戊巴比妥鈉（1mL/kg）靜脈麻醉后，截取原位再生腓骨組織（約1.5cm），同時截取對側相同部位的腓骨組織（約1.5cm），見圖2。用生理鹽水濕紗布將取下腓骨組織包裹，置于－20℃的冰箱中，以備實驗使用。

1.2.2 生物應力測定 采用島津萬能材料試驗機進行3點彎曲試驗，將包埋好的小白兔腓骨標本固定在2個支撐點上，連接傳感器的馬鞍形壓頭于腓骨中點處施加壓力。其中跨距為15mm，加載速度以1mm/min下壓腓骨，試驗以腓骨斷裂為終點。從計算機軟件上記錄荷載－跨中橈度曲線數(shù)據(jù)：最大荷載、彈性荷載、最大撓度、彈性橈度、彈性模量。

1.2.3 骨組織形態(tài)染色 制作骨組織切片。（1）取材固定：取骨干骨皮質，用鋸子取1.5cm×1.0cm×0.5cm骨組織固定于10%甲醛固定液內24h；（2）脫鈣：將固定好的骨組織放入10%EDTA脫鈣液，37℃恒溫下脫鈣48h，用細針能刺入骨頭內無阻力表示脫鈣完畢；（3）脫水：利用脫水機自動脫水；（4）包埋：骨組織按常規(guī)包埋入蠟；（5）切片：利用骨科切片機切取4μm的切片。

1.2.3.1 蘇木素－伊紅（HE）染色采用常規(guī)方法

1.2.3.2 ALP染色 應用ALP染色試劑盒按說明書進行染色，ALP著色呈灰黑色，光學顯微鏡下觀察。

圖2 再生的腓骨組織

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 X射線監(jiān)測結果 保留骨膜切取腓骨術后15d：移植區(qū)兩端有新骨形成，骨皮質連續(xù)性中斷，移植區(qū)有少許模糊影，骨痂影開始沿向由界面兩端向間隙中央生長，局部骨痂連接，間隙內呈低密度影像；30d：新生骨長入移植區(qū)，骨皮質連續(xù)性基本恢復，骨端界面較清晰，新生骨小梁充滿間隙；60d：取骨區(qū)形成完整的新骨，骨皮質完整連續(xù)，間隙內密度顯著增加，難以辨認骨端界面，骨紋理呈極向性排列，見圖3。不保留骨膜組術后15d：骨折兩端出現(xiàn)明顯骨痂生成；30d：骨痂從骨缺損兩端向中央推進，由高漸低呈楔形或斜坡狀，呈“推進形”骨痂；60 d：隨著骨缺損進一步修復與骨缺痂封閉，骨痂表損相鄰的脛骨側可見部分新生骨痂，形成類似截面“碗狀”骨缺損狀態(tài)，兩端新生骨面有大量骨痂成不規(guī)則狀，見圖4。

2.2 生物應力測定與對健側腓骨比較，再生腓骨骨干的最大荷載、彈性荷載、最大撓度、彈性橈度、彈性模量均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 組織學觀察 HE染色：實驗組骨組織骨皮質板層骨結構完整，骨陷窩內見骨細胞，哈弗斯管結構清晰、通暢，板層骨沿哈佛氏管排列，成熟骨皮質結構已經完成，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。ALP染色：實驗組與對照組骨皮質內側周邊及骨陷窩內散在染色均呈灰黑色，ALP的活性較活躍，顯示成骨細胞成骨能力強，ALP著色兩者差異無統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖3 保留骨膜術后15、30、60dX線片

表1 腓骨3點彎曲實驗（±s）

表1 腓骨3點彎曲實驗（±s）

組別 n 最大荷載（N） 彈性荷載（N） 最大撓度（mm） 彈性橈度（mm） 彈性模量（MPa）對照組 16 82.3±30.4 64.5±28.1 0.44±0.08 0.43±0.06 148.7±52.2實驗組 16 80.5±24.5 59.7±20.8 0.41±0.07 0.41±0.09 146.4±48.4

圖4 不保留骨膜術后15、30、60dX線片

圖5 各組組織學觀察

3 討 論

在骨再生及愈合過程中年齡具有重要的影響，幼兔處于生長期，其骨再生能力較成年及老年兔較強，因此本實驗采用3月齡骨再生能力較強的幼兔進行實驗。國內外關于骨缺損模型的長度存在一定的差異。有研究建立了骨缺損1.0、1.2、1.4、1.6和2.0cm組，結果橈骨中段缺損（包括骨膜）尺寸大于或等于1.4cm骨愈合低，模型更加可靠。Niemeyer等［8］截除橈骨遠端1.5cm骨段（包括骨膜）造骨缺損模型，術后骨缺損區(qū)，無骨性連接，骨缺損范圍0.8～1.2cm。而目前還沒有文獻報道腓骨骨缺損模型，在骨缺損模型建立中，腓骨和橈骨在解剖上都有脛骨和尺骨伴行，兩者在骨缺損愈合過程相近，故本研究選擇缺損1.5cm腓骨制作模型。本實驗切取腓骨組織后，通過X線片監(jiān)測，術后15d：移植區(qū)兩端有新骨形成，骨皮質連續(xù)性中斷，移植區(qū)有少許模糊影；術后30d：骨皮質連續(xù)性基本恢復；術后60d：骨皮質完整連續(xù)，取骨區(qū)形成完整的新骨。腓骨移植后移植區(qū)骨缺損的骨再生是1種特殊的過程，不僅是骨愈合的過程而且是骨再生的過程，其再生機制與骨折愈合相似，存在膜內成骨和軟骨成骨兩種方式［9］，但其又有所特點以膜內成骨為主，軟骨成骨為輔［10－11］。實驗組不保留骨膜完整切除腓骨及周圍骨膜后，術后X線片監(jiān)測結果提示缺損區(qū)未見骨性連接，缺損兩端可見大量骨痂形成。說明本實驗建立的骨缺損模型是可行的，同時也驗證了保留骨膜在骨缺損骨再生愈合中具有重要作用。

骨生物力學研究骨組織在外界作用下的力學特征和骨在受力后的生物學效應是反映骨強度的最敏感、最可靠的評價指標。本次試驗中，采用3點彎曲法檢測兔子腓骨的力學性能，此力學試驗適用于長骨（皮質骨）力學性能的測定［12］。本實驗中再生的腓骨與對側腓骨比較，其生物力學參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，腓骨移植后缺損區(qū)再生的腓骨具有良好的剛度、韌性及彈性，可與脛骨及周圍韌帶重新形成一個完整的力學結構，共同參與下肢的負重與活動，維持踝關節(jié)穩(wěn)定。ALP通常被認為是成熟的成骨細胞的標志之一，其活性的高低可反映成骨細胞的成熟狀況。本文ALP染色結果顯示再生的腓骨組織與正常腓骨組織的在成骨能力方面無明顯的差異。HE染色提示兩者亦無明顯差異，在組織形態(tài)上說明再生腓骨組織具有正常的組織結構，從內在結構上維持腓骨的功能。

通過本次試驗，發(fā)現(xiàn)再生的腓骨組織與正常的腓骨在生物應力、成骨能力、組織形態(tài)等方面并無明顯差異。從而第1次從實驗角度驗證了保留骨膜后再生的腓骨組織與正常的腓骨組織具有相同的生物功能及形態(tài)特點，可起到原有腓骨的功能。

在小兒骨科的臨床實踐過程中發(fā)現(xiàn)靠近關節(jié)的腫瘤、病理性骨折、慢性骨髓炎時常會面臨如何選取手術方式的困惑。由于靠近關節(jié)，而小兒骨骺發(fā)育尚未完全，直接放置內固定物會影響骨骼的發(fā)育、放置異體骨則產生骨不愈合或免疫排異等并發(fā)癥［5，13］。選取自體腓骨移植髓內固定骨折、填充骨缺損作為一種較為理想的手術方式，已在臨床上廣泛應用。但是蔡林等［14］通過對兒童行腓骨切除術后的長期隨訪中發(fā)現(xiàn)兒童腓骨切除后對踝關節(jié)的結構有影響，腓骨的穩(wěn)定性和完整性在防止踝關節(jié)外翻和脛骨遠端骨骺楔形樣改變起著重要作用。在臨床實踐中通過保留腓骨骨膜，可原位再生腓骨組織。因此，在臨床行腓骨移植時，臨床醫(yī)生應注意保留骨膜的完整性以原位再生腓骨，將供區(qū)的影響降至最低。

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