MicroRNA－21在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織中的表達(dá)及意義＊

雷學(xué)智，徐小龍，胡建敏，孫光曦，李 民，郭 穎，陳 樺，張煥標(biāo)，趙 明（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院器官移植科，廣州510282）

慢性腎臟病（CKD）在中國(guó)已經(jīng)成為最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［1－2］，而腎間質(zhì)纖維化（RIF）是CKD發(fā)展為終末期腎衰竭的共同路徑。大量研究證明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（TGF－β1）/Smad信號(hào)通路在器官纖維化的發(fā)展過(guò)程中起著主要作用［3］，且有報(bào)告指出TGF－β1/Smad信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)控下游多種microRNA，從而控制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及纖維化［4－6］。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于miRNA－21在腎臟纖維化機(jī)制中的作用報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定miRNA－21在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠腎臟組織中的表達(dá)，初步探討其在TGF－β1/Smad3信號(hào)通路中的機(jī)制及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇成年SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量200～220g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 RNAlater試劑（美國(guó)Sigma公司），RT primers（上海百力格生物技術(shù)有限公司），兔抗Smad3單克隆抗體（美國(guó) Milliproe公司），兔抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA）單克隆抗體（美國(guó) Milliproe公司），兔抗TGF－β1抗體（英國(guó)Abcam公司），兔抗Ⅰ型膠原蛋白（Col－Ⅰ），多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），免疫組織化學(xué)試劑盒（美國(guó)St.Louis公司），實(shí)時(shí)定量PCR引物（上?？党缮铮?。ViiA 7Real－time PCR System（美國(guó) Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、模型建立及標(biāo)本收集 20只SD大鼠分為UUO組和假手術(shù)組（Sham組），以5%異戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉滿意后，腹部皮膚備皮消毒，取左側(cè)腹部腎區(qū)切口進(jìn)入腹腔，UUO組大鼠游離左側(cè)輸尿管，并在其上1/3水平處及腎門(mén)處以4－0手術(shù)線結(jié)扎，逐層縫合關(guān)閉腹腔。Sham組大鼠只分離但不結(jié)扎左側(cè)輸尿管。將上述大鼠在建模后第3天、第7天在腹腔麻醉下以0℃生理鹽水灌注血管，并取兩組大鼠左側(cè)腎臟，將部分腎臟組織置于10%福爾馬林中固定，部分腎臟置于5倍體積的RNA later試劑中4℃孵育過(guò)夜后－20℃保存。

1.2.2 觀察及檢測(cè)

1.2.2.1 腎臟組織蘇木素－伊紅（HE）、Masson染色觀察 將固定在10%福爾馬林中的腎臟組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚石蠟切片，按常規(guī)方法進(jìn)行HE、Masson染色。切片HE染色觀察腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎小管萎縮和擴(kuò)張、間質(zhì)水腫、纖維化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等評(píng)價(jià)腎小管間質(zhì)損傷情況。Masson染色腎臟纖維化半定量評(píng)分［7］：在200倍視野下，隨機(jī)選取每張切片5個(gè)互不重疊的腎小管間質(zhì)視野，根據(jù)視野中膠原染色陽(yáng)性面積占整個(gè)視野面積的百分比進(jìn)行半定量分析，標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性面積小于2%，0分；陽(yáng)性面積2%～＜11%為輕度病變，1分；陽(yáng)性面積11%～＜21%為中度病變，2分；陽(yáng)性面積21%～30%為重度病變，3分；陽(yáng)性面積大于30%為極重度病變，4分。

1.2.2.2 腎臟組織免疫組織化學(xué)SP染色觀察 大鼠腎組織切片脫蠟和梯度乙醇脫水，在3%H2O2室溫下孵育阻斷內(nèi)源性H2O2酶，95℃煮沸行抗原修復(fù)，胎牛血清工作液封閉，一抗分別加入抗 TGF－β1（1∶100）、抗Smad3（1∶200）、抗α－SMA（1∶200）、抗Col－Ⅰ（1∶200），4℃孵育過(guò)夜，再依次加入生物素偶聯(lián)二抗、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵白素、DAB顯色、蘇木素復(fù)染，最后依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察，每張切片隨機(jī)取5個(gè)互不重疊視野拍照。Image－Pro Plus 6.0軟件分析每張照片中陽(yáng)性染色面積。TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ和α－SMA表達(dá)量以陽(yáng)性面積百分比表示。

1.2.2.3 實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè) microRNA－21的表達(dá) UUO組和Sham組大鼠第3天及第7天腎臟組織RNA抽提按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并使用紫外吸收對(duì)抽提出的RNA進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)，測(cè)得 A260/A280比值1.8～2.1，變性瓊脂糖凝膠電泳顯示總RNA完整。使用抽提出的腎臟組織RNA進(jìn)行cDNA合成，配備RT反應(yīng)液后在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RT反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real－time qPCR）檢測(cè)組織中microRNA－21，使用 U6作為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì) U6，F(xiàn)：5′－GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T－3′，R：5′－CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT－3′；rno－miR－21，GSP：5′－GGG GGG TAG CTT ATC AGA CTG－3′，R：5′－CAG TGC GTG TCG TGG AGT－3′，將 所 有 cDNA 樣 品 分 別 配 置 Real－time qPCR反應(yīng)體系，5 000r/min短暫離心。將8μL混合液加到384－PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，再加入對(duì)應(yīng)的2μL cDNA，短暫離心混合，在設(shè)置PCR程序前將準(zhǔn)備好的PCR板放在冰上，將上述384－PCR板置于Real－time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。U6指標(biāo)均按以下程序進(jìn)行：95℃，10min，40個(gè)PCR循環(huán)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按95℃，10 s；60℃，60s；95℃，15s，從60℃緩慢加熱到99℃（儀器自動(dòng)進(jìn)行－Ramp Rate為0.05℃/s）。各樣品的目的 miRNA和內(nèi)參（U6）分別進(jìn)行 Real－time qPCR 反應(yīng)，數(shù)據(jù)采用2－△△CT法進(jìn)行分析，Sham組2－△△CT為1作為基準(zhǔn)校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腎臟病理結(jié)果 觀察HE染色切片，Sham組腎單位大小形態(tài)未見(jiàn)異常；UUO組建模后3d見(jiàn)腎小管輕度擴(kuò)張、小管上皮空泡樣變，間質(zhì)輕度水腫并散在炎癥細(xì)胞，建模后7d即可觀察到明顯的腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，證明建模成功。在光鏡下觀察Masson染色大鼠腎臟組織，Sham組第3天和第7天腎單位及間質(zhì)未見(jiàn)異常；UUO組建模后第3天，可見(jiàn)腎小管管腔輕度擴(kuò)張，部分間質(zhì)可見(jiàn)少量淡藍(lán)色膠原組織沉積，UUO組建模后第7天，腎小管較第3天模型組明顯擴(kuò)張，間質(zhì)水腫增寬明顯伴單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，間質(zhì)膠原纖維進(jìn)行性增多、面積擴(kuò)大、藍(lán)染加重（圖1）。UUO組和Sham組3d、7d組織Masson染色膠原陽(yáng)性面積評(píng)分組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝194.228，P＜0.01），UUO組3d和7d腎臟組織纖維化程度評(píng)分明顯高于同時(shí)期Sham組（P＜0.01），UUO組7d纖維化面積與3 d相比顯著增多（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖1 兩組大鼠腎臟組織病理形態(tài)（Masson×200）

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)腎臟中microRNA－21的表達(dá) 建模后3、7d UUO和Sham組腎組織中miRNA－21表達(dá)組間存在差異［（2.33±0.46）vs.（3.50±0.41），F(xiàn)＝61.381，P＜0.01］；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織中miRNA－21在UUO組3d和7d的表達(dá)量與Sham組（1.00±0.00）比較明顯升高（P＜0.01），7d UUO組腎組織中miRNA－21較3dUUO組明顯升高（P＝0.008）。

圖2 兩組大鼠腎臟Masson染色膠原面積評(píng)分

2.3 兩組大鼠腎臟組織不同時(shí)間點(diǎn) TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ、α－SAM免疫組織化學(xué)表達(dá) Sham組大鼠3d及7d腎臟組織中TGF－β1僅在腎小管上皮細(xì)胞中少量表達(dá)，間質(zhì)中無(wú)表達(dá)，且各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。與Sham組相比，UUO組3d、7d TGF－β1在腎小管上皮細(xì)胞和組織間質(zhì)表達(dá)面積隨時(shí)間逐漸增多，陽(yáng)性染色逐漸加深。UUO組和Sham組3d、7d腎臟組織TGF－β1陽(yáng)性面積組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝423.844，P＜0.01），UUO組TGF－β1陽(yáng)性面積與同時(shí)期Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），UUO組7dTGF－β1陽(yáng)性面積較UUO組3d增多（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。

Sham組大鼠3d及7d腎臟組織中Smad3表達(dá)無(wú)明顯變化，表達(dá)于少部分腎小管上皮細(xì)胞中。UUO組3d、7dSmad3與Sham組相比，在腎小管上皮細(xì)胞、組織間質(zhì)表達(dá)面積明顯增多，且強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于UUO組7d組織。UUO組和Sham組各時(shí)間點(diǎn)腎臟組織Smad3陽(yáng)性面積組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝768.544，P＜0.01），UUO組Smad3陽(yáng)性面積明顯多于同時(shí)期Sham組（P＜0.01），UUO組7dSmad3陽(yáng)性面積多于UUO組3d（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。

Sham組Col－Ⅰ在腎小管間質(zhì)少量表達(dá)，與同時(shí)間Sham組比較，UUO組大鼠腎臟組織Col－Ⅰ蛋白表達(dá)面積明顯增多，建模后時(shí)間越長(zhǎng)，陽(yáng)性面積表達(dá)越多（圖4）。組間Col－Ⅰ表達(dá)面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1108.079，P＜0.01），各組間兩兩比較，UUO組Col－Ⅰ陽(yáng)性面積多于同時(shí)期Sham組（P＜0.01），UUO組7dCol－Ⅰ陽(yáng)性面積多于 UUO 組3d（P＜0.01）（圖3C）。α－SMA在Sham 組陽(yáng)性面積較少，UUO組α－SMA在腎組織間質(zhì)中表達(dá)面積隨建模后時(shí)間延長(zhǎng)增多，7d陽(yáng)性染色最深（圖4）。組間α－SMA表達(dá)面積具有明顯差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝292.363，P＜0.01），各組間兩兩比較，UUO組α－SMA陽(yáng)性面積多于同時(shí)期Sham組（P＜0.01），UUO組7d α－SMA陽(yáng)性面積明顯較UUO組3d增多（P＜0.01）（圖3D）。

圖3 兩組大鼠腎組織 TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ和α－SMA蛋白陽(yáng)性面積比較

圖4 兩組大鼠腎組織不同時(shí)間點(diǎn)Col－Ⅰ和α－SMA蛋白表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)染色×200）

2.4 相關(guān)性分析 TGF－β1、Smad3與腎組織中 miRNA－21呈正相關(guān)（r＝0.799、0.849，P＜0.01），腎組織 miRNA－21與腎組織 纖 維 化 程 度、Col－Ⅰ 和 α－SMA 呈 正 相 關(guān)（r＝0.888、0.882、0.896，P＜0.01）。

3 討 論

纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度積聚、成纖維細(xì)胞增生，以及腎單位萎縮消失等為病理特點(diǎn)［4］，是腎、心、肺、肝等器官發(fā)生漸進(jìn)性疾病，最終發(fā)展為終末期器官衰竭的共同通路，但是對(duì)于腎臟纖維化發(fā)生的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不完全明確［8］。MicroRNAs是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物基因組中的功能性非編碼小分子RNA，主要功能是通過(guò)與靶基因mRNA特定位點(diǎn)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平參與基因的表達(dá)和調(diào)控，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，microRNA參與幾乎每個(gè)細(xì)胞的生理及病理發(fā)生過(guò)程，而且miRNAs的異常調(diào)節(jié)與包括CKD在內(nèi)的眾多人類(lèi)疾病密切相關(guān)。

UUO大鼠是腎臟炎癥及RIF公認(rèn)經(jīng)典模型，HE染色顯示隨著UUO建模時(shí)間延長(zhǎng)，腎間質(zhì)損害逐漸加重，Masson染色也觀察到實(shí)驗(yàn)組術(shù)后間質(zhì)纖維化程度加重，證明大鼠腎臟間質(zhì)纖維化模型建模成功。TGF－β1/Smad3是纖維化發(fā)生機(jī)制中重要的信號(hào)通路之一［3］，TGF－β1通過(guò)下游受體激活型介質(zhì)Smad3、Smad2正向調(diào)控致纖維化基因表達(dá)從而介導(dǎo)EMT［9］，另一方面，大部分RIF來(lái)源于損傷腎組織通過(guò)Ⅱ型EMT而來(lái)的腎小管上皮細(xì)胞，通過(guò)EMT機(jī)制，腎小管上皮細(xì)胞失去頂點(diǎn)－基底極性，形態(tài)變細(xì)長(zhǎng)，破壞基底膜從而侵入腎小管間隙，并表達(dá)α－SMA等間皮細(xì)胞標(biāo)志，產(chǎn)生以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的ECM［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，3dUUO組腎組織纖維化評(píng)分較低，腎臟組織中 TGF－β1、Smad3蛋白少量表達(dá)，且α－SMA 和 Col－Ⅰ亦有陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明是腎臟纖維化和EMT的初期階段，但是7dUUO組腎臟組織masson染色纖維化評(píng)分較3d組明顯升高，腎組織中 TGF－β1、Smad3、α－SMA、Col－Ⅰ陽(yáng)性面積較3dUUO組顯著增多、染色加深，可見(jiàn)隨著建模后時(shí)間延長(zhǎng)，TGF－β1/Smad3信號(hào)通路被激活，組織纖維化和EMT程度伴隨TGF－β1、Smad3表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)行性加重。

在腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞，很多miRNAs接受TGF－β1的調(diào)控，例如miRNA－21、miRNA29家族、miRNA93、miRNA377、miR－216a、miRNA200家族［11］，在RIF發(fā)展過(guò)程中，上述miRNAs表達(dá)是通過(guò) TGF－β1/Smad3這一信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)［12－13］，而不是依賴Smad2［12］，保守的 Smad3結(jié)合在 miRNA－21、miRNA29、miRNA－192啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)，所以miRNAs可能是TGF－β1/Smad3信號(hào)通路調(diào)控腎臟纖維化的重要下游介質(zhì)［4］。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UUO組大鼠腎臟組織中miRNA－21在建模后3d、7d呈增加趨勢(shì)，并與TGF－β1/Smad3蛋白、腎組織纖維化評(píng)分、α－SMA、Col－Ⅰ呈正相關(guān)，所以 TGF－β1/Smad3可能通過(guò)上調(diào)miRNA－21從而誘導(dǎo)EMT導(dǎo)致RIF。

綜上所述，UUO大鼠腎組織中miRNA－21隨纖維化程度加重表達(dá)上調(diào)，TGF－β1/Smad3信號(hào)通路可能通過(guò)正向調(diào)控miRNA－21從而誘導(dǎo)RIF。隨著檢測(cè)技術(shù)及對(duì)miRNA進(jìn)一步研究，miRNA有望成為預(yù)測(cè)及診斷CKD新型標(biāo)志物。

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