電離輻射對小鼠骨髓c－kit陽性細(xì)胞損傷效應(yīng)體外研究＊

張俊伶，劉 冰，路 璐，李德冠，孟愛民

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所/天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300192）

造血系統(tǒng)對電離輻射高度敏感，電離輻射能夠引起造血系統(tǒng)損傷，包括急性骨髓抑制和持久性骨髓損傷。急性骨髓抑制在受到照射后很快發(fā)生，主要是快速增殖的造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）損傷所致。持久性骨髓損傷是輻射遠(yuǎn)期損傷的主要表現(xiàn)，主要是由于電離輻射引起的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）損傷所致［1－2］。c－kit＋細(xì)胞是一群經(jīng)過富集的富含HPC和HSC的一類細(xì)胞，目前利用磁珠分選系統(tǒng)能在短時(shí)間內(nèi)快速分選出大量的c－kit＋細(xì)胞，因此對c－kit＋細(xì)胞電離輻射損傷的研究能夠初步反應(yīng) HPC和HSC損傷情況，對輻射引起造血系統(tǒng)損傷機(jī)制研究及損傷防護(hù)藥的初步篩選具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 無血清擴(kuò)增培養(yǎng)基SFEM，購自Stem Cell Technologies公司；c－kit磁珠，購自美天旎公司；細(xì)胞活力檢測試劑盒Celltiter－Glo，購自Promega公司；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基 M3534，購自Stem Cell Technologies公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶（PI）染液，購自索萊寶公司；凋亡檢測試劑盒，購自BD公司。多功能酶標(biāo)儀，型號(hào)InfiniteM200，購自 TECAN公司。137Csγ射線輻射源，型號(hào)USD，Autocell40，購自加拿大原子能有限公司；流式細(xì)胞儀，型號(hào)C6，購自BD公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（SPF）級C57BL/6雄性小鼠15只，18～25g，購自維通利華，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 c－kit＋細(xì)胞分離 無菌分離小鼠雙側(cè)股骨脛骨，去除表面附著肌肉，用2.5mL一次性無菌注射器在磷酸鹽緩沖液（PBS）中將骨髓細(xì)胞沖出，計(jì)數(shù)獲取的細(xì)胞數(shù)目。每1×108細(xì)胞加20μL的c－kit磁珠，冰上孵育30min，孵育結(jié)束后加入5mL PBS，離心1 500r/min，5min。離心完畢用10mL PBS重懸細(xì)胞，利用磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行c－kit＋細(xì)胞分離［3］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組，對照組：取1×107個(gè)/mL濃度的c－kit＋細(xì)胞懸液600μL加入至2mL EP管內(nèi)，再加入無血清擴(kuò)增（SFEM）培養(yǎng)基600μL吹打混勻。1Gy照射組：在對照組基礎(chǔ)上進(jìn)行1Gy劑量γ射線照射；4Gy照射組：在對照組基礎(chǔ)上進(jìn)行4Gy劑量γ射線照射。

1.2.3 小鼠c－kit＋細(xì)胞活力檢測 將細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔200μL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置4個(gè)平行孔。每孔加入20 μL生物發(fā)光試劑，室溫避光震蕩孵育30min，多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞發(fā)光值。

1.2.4 小鼠c－kit＋細(xì)胞克隆形成能力檢測 0Gy接種細(xì)胞濃度1×104個(gè)/mL、1Gy接種細(xì)胞濃度2×104個(gè)/mL、4Gy接種細(xì)胞濃度1×105個(gè)/mL（根據(jù)前期系列預(yù)實(shí)驗(yàn)提示，以上接種細(xì)胞濃度在顯微鏡下計(jì)數(shù)最為適宜，克隆數(shù)目既不會(huì)太多也不會(huì)太少；隨照射劑量增加，造血祖細(xì)胞損傷嚴(yán)重，形成克隆數(shù)目減少，所以隨照射劑量增加需要加大接種細(xì)胞濃度）。調(diào)整細(xì)胞濃度為接種濃度的10倍，加0.2mL細(xì)胞至2mL M3534，振蕩器充分混勻，靜置2～5min，待氣泡消失。用2.5 mL注射器連接16＃平頭注射器針頭，吸取0.5mL細(xì)胞混懸液，加入24孔板，輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5天低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)大于或等于30為陽性集落。

1.2.5 小鼠c－kit＋細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測 將c－kit＋細(xì)胞懸液1mL加入2mL無菌EP管內(nèi)，1 500r/min，離心5min后棄上清液。每管內(nèi)加入500μL ROS檢測探針［無血清1640與ROS探針（DCFH－DA）比例為3 000∶1］，37℃ CO2水浴鍋內(nèi)孵育30min后離心，棄去上清液后用無血清RPMI－1640培養(yǎng)基洗滌3次以洗去多余未結(jié)合探針，最后用無血清RPMI－1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸起，流式細(xì)胞儀檢測熒光素（FITC）通道平均熒光強(qiáng)度。

1.2.6 小鼠c－kit＋細(xì)胞周期檢測 取c－kit＋細(xì)胞懸液500 μL，加入1mg/mL的PI染液25μL，使PI染液終濃度為50 μg/mL，室溫避光孵育1h。孵育結(jié)束加5mL體積的PBS溶液，1 500r/min，離心5min后棄上清液。加入200μL體積的PBS溶液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.7 小鼠c－kit＋細(xì)胞凋亡檢測 取c－kit＋細(xì)胞懸液，離心去上清液后加入100μL BD凋亡試劑盒內(nèi)1×Binding buffer試劑，加入BD凋亡試劑盒內(nèi)的Annexin V試劑和7－AAD試劑各5μL，室溫避光孵育15min，再加入BD凋亡試劑盒內(nèi)1×Binding buffer試劑200μL，流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。

1.2.8 小鼠c－kit＋細(xì)胞受照射后發(fā)生改變的信號(hào)通路分析取c－kit＋細(xì)胞懸液，離心去上清液后加入1mL體積的Trizol試劑，交由上海康成生物工程有限公司進(jìn)行全基因組的基因芯片分析后進(jìn)行聚類分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電離輻射對小鼠c－kit＋細(xì)胞活力、細(xì)胞克隆形成能力（CFU－GM）及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響與對照組比較，受照射后小鼠c－kit＋細(xì)胞活力下降，細(xì)胞克隆形成能力下降，以上兩項(xiàng)檢測指標(biāo)隨細(xì)胞受照射劑量增加而遞減。與對照組比較，受照射后小鼠c－kit＋細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，且隨照射劑量增加遞增，見表1。

2.2 電離輻射對小鼠c－kit＋細(xì)胞S/G2/M 期、早期凋亡及晚期凋亡的影響與對照組比較與對照組比較，受1Gy照射后小鼠處于S/G2/M 期細(xì)胞比例增加（P＜0.05），受4Gy照射后小鼠c－kit＋細(xì)胞處于S/G2/M 期細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05）。與對照組比較，受照射后小鼠早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞比例隨照射劑量加大而明顯增加，見表2。

表1 受照射后c－kit＋細(xì)胞細(xì)胞活力、克隆形成能力、細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化（±s）

表1 受照射后c－kit＋細(xì)胞細(xì)胞活力、克隆形成能力、細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化（±s）

a：P＜0.01，與對照組比較。

組別 細(xì)胞活力（RLU）克隆數(shù)目（個(gè)/105細(xì)胞） ROS（MFI）n 4 6 3對照組 333 837.5±3 339.6 705.0±53.9 733 933.0±71 742.8 1Gy組 187 787.5±2 568.5a 340.8±22.0a1 795 565.0±230 079.6a 4Gy組 101 239.3±2 197.7a 22.7±4.6a2 815 854.0±189 153.2a

表2 受照射后c－kit＋細(xì)胞S/G2/M期、早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞比例變化（±s）

表2 受照射后c－kit＋細(xì)胞S/G2/M期、早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞比例變化（±s）

a：P＜0.05，與對照組比較。

組別 S/G2/M 期細(xì)胞比例（%）早期凋亡細(xì)胞比例（%）晚期凋亡細(xì)胞比例（%）26.3±2.6 3.2±0.4 1.3±0.2 1Gy組 32.3±0.5a 4.5±0.7a 2.3±0.3a 4Gy組 19.9±0.2a 11.0±1.0a 4.5±0.5對照組a

2.3 小鼠c－kit＋細(xì)胞受照射后上調(diào)基因變化與對照組比較，c－kit＋細(xì)胞受4Gy劑量γ射線照射后，氧化應(yīng)激相關(guān)的2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞周期相關(guān)的34個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞凋亡相關(guān)的35個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，見表3。

表3 表達(dá)升高2倍以上的前10位基因

2.4 小鼠c－kit＋細(xì)胞受照射后下調(diào)基因變化與對照組比較，c－kit＋細(xì)胞受4Gy劑量γ射線照射后，氧化應(yīng)激相關(guān)的6個(gè)基因表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞周期相關(guān)的96個(gè)基因表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞凋亡相關(guān)的56個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，見表4。

表4 表達(dá)降低2倍以上的前10位基因

3 討 論

HSC是造血系統(tǒng)中一類特殊的的細(xì)胞群，在進(jìn)行自我更新的同時(shí)能夠定向分化為HPC及各類成熟的血液細(xì)胞。c－kit又名CD117，是特異性存在于HSC及HPC表面的抗原分子，c－kit能夠與干細(xì)胞因子特異性結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的生存及增殖［4］。由于在已經(jīng)成熟分化的造血細(xì)胞表面沒有c－kit的表達(dá)，因此本研究選用c－kit＋細(xì)胞群研究電離輻射對 HSC及HPC損傷效應(yīng)及損傷相關(guān)的基因表達(dá)變化。

研究提示，c－kit＋細(xì)胞在經(jīng)過1Gy和4Gy劑量照射后，細(xì)胞活力下降，造血祖細(xì)胞克隆形成數(shù)目減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，這些變化隨照射劑量的增加而呈遞減或遞增變化。研究結(jié)果與之前對小鼠進(jìn)行整體照射后的HSC變化一致［5－7］，說明對c－kit＋細(xì)胞體外研究能夠反映全身照射小鼠造血系統(tǒng)變化。本研究進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀對電離輻射后c－kit＋細(xì)胞增殖凋亡變化進(jìn)行分析，結(jié)果提示，經(jīng)過1Gy照射后，處于增殖期（S/G2/M 期）c－kit＋細(xì)胞比例明顯增加，凋亡細(xì)胞明顯增加；然而經(jīng)過4Gy照射后，處于增殖期（S/G2/M 期）c－kit＋細(xì)胞比例明顯下降，凋亡細(xì)胞明顯增加。分析上述結(jié)果，低劑量的電離輻射（1Gy）較短時(shí)間內(nèi)可能會(huì)刺激c－kit＋細(xì)胞進(jìn)入增殖期，對電離輻射引起的細(xì)胞損傷起到代償作用，然而，受損傷后發(fā)生凋亡的細(xì)胞明顯多于增殖細(xì)胞，導(dǎo)致1Gy照射后存活細(xì)胞減少。隨著照射劑量增加到4Gy，增殖細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增加，存活細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步減少。對細(xì)胞增殖和凋亡的檢測能夠更深入地解釋細(xì)胞活力隨照射劑量的增加而下降的現(xiàn)象。

電離輻射引起HSC及HPC損傷的分子機(jī)制尚不完全明確，已有的研究提示電離輻射引起 ROS－NOX4－p38MAPK－p16，ATM－Chk2－p53－p21［6，8］等信號(hào)通路發(fā)生變化，對這些基因采取激活或者抑制的方法不能完全阻斷電離輻射引起的HSC及HPC損傷。因此對c－kit＋細(xì)胞進(jìn)行4Gy照射后，提取細(xì)胞RNA進(jìn)行全基因組基因芯片分析，對分析出的基因進(jìn)行進(jìn)一步的聚類分析，總結(jié)出經(jīng)過照射后表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的與氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的一系列相關(guān)基因，并列表總結(jié)出涉及以上細(xì)胞生物學(xué)過程的表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的前十位基因。結(jié)果提示，氧化應(yīng)激相關(guān)的基因Srxn1［9］、Psmb5［10］，細(xì)胞周期相 關(guān) 的 Cdkn1a［8］、Smc1b［11］等基因，細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl2l1［12］、Lrdd［13］等基因表達(dá)上調(diào)。氧化應(yīng)激相關(guān)的Mpo［14］、Mtf1［15］等基因，細(xì)胞周期相關(guān)的 Chek1［16］、Rcc1［17］等基因，細(xì)胞凋亡相關(guān)的Ebag9、Ciapin1［18］等基因表達(dá)下調(diào)。之前的關(guān)于電離輻射對小鼠造血干祖細(xì)胞損傷的研究都較少涉及以上相關(guān)基因，進(jìn)一步的研究工作可以參考以上基因表達(dá)變化，因此篩選出的新基因?qū)υ煅到y(tǒng)電離輻射損傷研究可能具有重要意義。

綜上，本研究在體外水平分析了受到不同劑量照射后，ckit＋細(xì)胞在細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞功能、細(xì)胞增殖及凋亡水平的變化，進(jìn)一步揭示了引起這些變化可能存在的分子機(jī)制，為電離輻射導(dǎo)致HSC及HPC損傷的研究奠定了基礎(chǔ)，具有重要的提示意義。

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