嗜酸乳桿菌S層蛋白抗NDV感染雞腸上皮細(xì)胞作用初探

張 萍，賈國(guó)東，魏 萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

益生菌具有抗致病微生物的作用已經(jīng)得到普遍認(rèn)識(shí)，其菌群中特別是嗜酸乳桿菌具有較明顯的抗致病微生物性質(zhì)[1]。S層蛋白是嗜酸乳桿菌表層重要的蛋白質(zhì)，有保護(hù)菌體維持形狀、作為物質(zhì)交換的分子過濾篩、參與細(xì)胞識(shí)別與粘附等功能，而且是菌體適應(yīng)周圍環(huán)境的重要結(jié)構(gòu)，S層蛋白具有粘附小腸上皮細(xì)胞的特性，是腸道內(nèi)益生菌定植不可或缺的結(jié)構(gòu)[2-4]。為了證實(shí)S層蛋白在菌體發(fā)揮抗病毒功能中的作用程度,評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌抑制病毒感染宿主細(xì)胞的能力，本試驗(yàn)以嗜酸乳桿菌為益生菌的代表，評(píng)價(jià)與研究S層蛋白在抗病毒作用中的參與程度以及作用原理，以期為益生菌的后續(xù)研究提供最基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 嗜酸乳桿菌（La-A），毒株:新城疫IV系疫苗毒（LaSota 株），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存。

1.2 NDV的細(xì)胞毒力測(cè)定 采用Reed-Muench 法測(cè)定兩種病毒各自的半數(shù)組織感染量（TCID50）。

1.3 嗜酸乳桿菌試驗(yàn)前處理

1.3.1 菌體活化 試驗(yàn)時(shí)經(jīng)MRS平板活化后，37 ℃培養(yǎng)21～24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3 代。

1.3.2 益生菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將完成活化菌株按0.1 mL/管的接種量分別接于11 支盛有10 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，測(cè)其600 nm 處的光密度值（OD600值）。

1.3.3 嗜酸乳桿菌藥敏試驗(yàn) 結(jié)果參照文獻(xiàn)：1 000 U/mL 的慶大霉素能顯著抑制此菌的生長(zhǎng)。

1.3.4 菌體的細(xì)胞毒性測(cè)定 將已處理好的不同濃度活菌體加入已長(zhǎng)成單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置溫箱中培養(yǎng)90 min，之后棄去孔中液體，再加入含有1 000 U/mL 慶大霉素細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。按時(shí)觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，測(cè)定細(xì)胞活性得到其最大無毒劑量。

1.4 S層蛋白對(duì)IEC毒力的測(cè)定 將蛋白按照以下濃度梯度用細(xì)胞維持液稀釋0.2 mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL，0.6 mg/mL，0.7 mg/mL，0.8 mg/mL，0.9 mg/mL，1.0 mg/mL 加入待檢細(xì)胞。按時(shí)觀察細(xì)胞病變（CPE）情況，測(cè)定細(xì)胞活性得到其最大無毒劑量。

1.5 嗜酸乳桿菌不同成分抗NDV感染IEC作用研究 試驗(yàn)分3 種處理如下：（1）預(yù)防性試驗(yàn)。預(yù)先將每個(gè)試驗(yàn)組成分以0.1 mL 量分別孵育細(xì)胞90 min，后以100 TCID50/0.1 mL 的病毒量接入細(xì)胞孔0.1 mL，再次孵育90 min，洗滌后加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；（2）治療性試驗(yàn)。以100 TCID50/0.1 mL 的病毒量0.1 mL 接入細(xì)胞孔與細(xì)胞孵育90 min，后加入0.1 mL 每個(gè)試驗(yàn)組繼續(xù)孵育90 min，之后洗滌加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；（3）混合感作試驗(yàn)。將各個(gè)試驗(yàn)組分別與100 TCID50/0.1 mL的病毒等體積孵育90 min，之后共同接入細(xì)胞，繼續(xù)孵育90 min，之后洗滌加入正常維持液培養(yǎng)。用MTT 方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

1.6 檢測(cè)S層蛋白與牛血清白蛋白對(duì)NDV的粘附能力 用常規(guī)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)S層蛋白與牛血清白蛋白對(duì)NDV的粘附能力，測(cè)定OD490nm 值。

1.7 S層蛋白與牛血清白蛋白抗病毒感染IEC將各個(gè)試驗(yàn)組分別與100 TCID50/0.1 mL 的病毒等體積孵育90 min，之后共同接入細(xì)胞，繼續(xù)孵育90 min，之后洗滌加入正常維持液培養(yǎng)孵育。S層蛋白稀釋度與白蛋白稀釋度0.1～1.0 mg/mL。

2 結(jié)果

2.1 NDV的細(xì)胞毒力測(cè)定結(jié)果 用Reed-Muench法計(jì)算得NDV毒力為10-3.85TCID50/0.1 mL。

2.2 嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線

2.2.1 嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)曲線 試驗(yàn)選取其進(jìn)入穩(wěn)定期21 h 為收獲菌體時(shí)間點(diǎn)。

2.2.2 嗜酸乳桿菌的最大無毒劑量結(jié)果 通過觀察細(xì)胞CPE 變化程度，得出嗜酸乳桿菌最大無毒劑量為1011CFU/mL。

2.3 嗜酸乳桿菌不同成分抗NDV感染IEC作用試驗(yàn)結(jié)果與分析 表1 數(shù)據(jù)顯示，菌體對(duì)抑制病毒的抑制率隨濃度升高而增強(qiáng)，108CFU/mL 濃度時(shí)最高抑制性。

表1 菌體不同接入順序?qū)DV抑制率的組間比較（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

表2 數(shù)據(jù)可見，脫S層蛋白菌體對(duì)病毒依然具有抑制性，治療試驗(yàn)對(duì)病毒的抑制率極顯著的低于其他兩組，混合感作試驗(yàn)比預(yù)防試驗(yàn)組的病毒抑制率顯著性增強(qiáng)。

表2 脫S層蛋白菌體不同接入順序?qū)DV抑制率的組間比較（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

表3 數(shù)據(jù)中S層蛋白最強(qiáng)作用濃度0.8 mg/mL，其中在每組濃度數(shù)據(jù)中，0.7～1.0 mg/mL 組的混合感作試驗(yàn)抑制病毒效果顯著性高于預(yù)防組、極顯著高于治療組；0.3～0.6 mg/mL 組中混合感作組抑制病毒率顯著高于預(yù)防組，極顯著高于治療組。

表4 數(shù)據(jù)顯示，2、4、6 倍稀釋液的病毒抑制率中，混合感作試驗(yàn)顯著強(qiáng)于預(yù)防組，極顯著強(qiáng)于治療組；8、10 倍稀釋液的病毒抑制率中，預(yù)防組與混合感作組作用相當(dāng)，都顯著強(qiáng)于治療組；12倍的抑制率三者均較低，作用強(qiáng)度無顯著差異。

2.4 S層蛋白和牛血清白蛋白對(duì)NDV粘附能力試驗(yàn)結(jié)果 表5 數(shù)據(jù)顯示，S層蛋白和牛血清白蛋的組間比較（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）白對(duì)NDV粘附量均隨蛋白濃度增大而增加，S層蛋白對(duì)病毒的粘附性稍強(qiáng)于白蛋白對(duì)病毒的粘附。

表3 S層蛋白不同接入順序?qū)DV抑制率

表4 菌體培養(yǎng)上清液不同接入順序?qū)DV抑制率的組間比較 （平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.5 S層蛋白與牛血清白蛋白抗病毒感染IEC試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)混合感作方式試驗(yàn)得出S層蛋白在濃度0.6 mg/mL 時(shí)的抑制NDV能力為0.826±0.022Aa，而同濃度下白蛋白為0.196±0.018Bb。由此可見，S層蛋白在此濃度下抑制病毒能力顯著高于白蛋白。

表5 S層蛋白和白蛋白粘附性

3 討論

活菌體主要是通過占位作用、粘附病毒、封閉細(xì)胞表面病毒受體和改善細(xì)胞自身狀態(tài)來發(fā)揮其抗病毒作用的。從試驗(yàn)結(jié)果來看，S層蛋白對(duì)NDV抑制率最大達(dá)到88.9%，脫S層蛋白菌體對(duì)NDV抑制率最大達(dá)到48.9%，由此可見，S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中發(fā)揮了重要的作用。通過粘附試驗(yàn)可以看出，S層蛋白具有對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附能力，既是嗜酸乳桿菌定植的關(guān)鍵蛋白，又具有對(duì)一些病毒的粘附能力從而降低病毒的感染。在預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，菌體成分預(yù)防試驗(yàn)和混合感作試驗(yàn)的兩種病毒抑制率都高于治療試驗(yàn)，說明當(dāng)病毒感染細(xì)胞，益生菌成分無法起到明顯的抑制病毒增殖性質(zhì)。菌體在代謝過程中產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如細(xì)菌素、維生素、多糖、小分子肽類及酸性代謝產(chǎn)物等等。在這些成分的刺激下可以抑制病毒活力，影響病毒對(duì)宿主細(xì)胞的粘附，還可以提高宿主細(xì)胞的自身免疫功能水平，綜合起到抑制病毒感染宿主細(xì)胞的作用。通過以上試驗(yàn)可以看出，菌體對(duì)病毒的抑制作用是多方面共同發(fā)揮的結(jié)果，本試驗(yàn)僅是建立了雞原代培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞作為平臺(tái)，進(jìn)行了菌體抗病毒的初步探索，對(duì)S層蛋白抗病毒的具體機(jī)制還需要深入研究。

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