鹽酸吸入聯(lián)合機(jī)械通氣建立暴喘癥大鼠模型

黃小紅，黃紅坤，孫 俠，劉盛來(lái)，許惠英，唐小江

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248）

急性呼吸窘迫綜合征（暴喘癥）病因復(fù)雜，胃內(nèi)容物誤吸是臨床常見(jiàn)病因之一，其發(fā)病率逐年升高，死亡率高達(dá)40%左右。事實(shí)上，對(duì)暴喘癥的很多研究都是在動(dòng)物急性肺損傷模型上進(jìn)行的。根據(jù)致病因素研制模型，再根據(jù)模型研究其病理生理變化過(guò)程并擬定治療方案[1]。因此，模擬臨床常見(jiàn)病因建立相應(yīng)的動(dòng)物模型具有非常重要的意義。目前建立理想的誤吸所致暴喘癥動(dòng)物模型是研究得以深入的關(guān)鍵。以往主要通過(guò)單純鹽酸吸入、鹽酸酸化后人乳滴入等方式制備該動(dòng)物模型，損傷局限于肺部，難以造成呼吸窘迫程度。本研究模擬臨床誤吸病因，采用鹽酸吸入，同時(shí)聯(lián)合機(jī)械通氣的方法，使動(dòng)物出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，為進(jìn)一步開(kāi)展誤吸造成的暴喘癥研究提供工作平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD大鼠，30 只，雄性，8～10周齡，體重300～350 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：4407208423。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用經(jīng)本中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 飼養(yǎng)條件 大鼠飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)溫濕度為20 ℃～26 ℃、40%～70%，采用10 h：14 晝夜間斷照明。喂以大鼠維持飼料（來(lái)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），自由進(jìn)食飲水。

1.3 儀器與試劑 HX-300S動(dòng)物呼吸機(jī)，成都泰盟科技有限公司，LXJ-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠，CX21 生物顯微鏡，日本奧林巴斯廠，RM2135 輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司，RS-18 生物組織全自動(dòng)染色機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司，BX41 病理圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯廠，濃鹽酸，批號(hào)20110901，廣州化學(xué)試劑二廠生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)方法 將檢疫合格的30 只SD大鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、小通氣量模型組、大通氣量模型組，10 只/組。（1）除正常對(duì)照組外，大鼠用2%戊巴比妥鈉按60 mg/kg 體重腹腔注射麻醉后，75%酒精消毒剃毛部位，手術(shù)依次剪開(kāi)皮膚，分離暴露氣管。接著，向氣管注入0.1 mol/L 鹽酸；（2）隨后進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機(jī)通氣（小通氣量模型組通氣量為6 mL/kg 體重，大通氣量模型組通氣量為15 mL/kg 體重）；（3）連續(xù)通氣6 h后放血處死大鼠，剖檢取左右肺組織。

指標(biāo)檢測(cè)：（1）右上肺組織進(jìn)行肺泡灌洗，所得肺泡灌洗液（BALF）4 ℃1 000 r/min 離心10 min，去上清后，無(wú)菌生理鹽水重懸，細(xì)胞涂片并進(jìn)行瑞氏染色，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)灌洗液嗜中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞分類百分比；（2）對(duì)左肺組織計(jì)算左肺組織濕干重比：置于60 ℃干燥箱中連續(xù)干燥48 h。左肺肺組織濕干重比=左肺肺組織干燥前重量/干燥后重量，即為左肺含水量；（3）組織病理學(xué)檢查：右肺4%多聚甲醛固定后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片，H.E.染色、封片，顯微鏡下閱片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 各檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示（X±s），采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件方差分析、秩和檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物觀察 造模后，小通氣量模型組大鼠呼吸頻率加快，出現(xiàn)輕度呼吸窘迫癥狀，大通氣量模型組大鼠呼吸頻率加快，出現(xiàn)中重度呼吸窘迫癥狀，口唇及指端發(fā)紺；正常對(duì)照組大鼠無(wú)異常。

2.2 左肺組織濕干重比 與正常對(duì)照組比較，小通氣量模型組、大通氣量模型組大鼠左肺組織濕干重比顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.3 肺泡灌洗液嗜中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞比例

表1 大鼠左肺組織濕干重比及肺泡灌洗液嗜中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞比例結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，小通氣量模型組、大通氣量模型組大鼠肺BALF 液嗜中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞比例顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.4 肺部組織病理學(xué)觀察 剖檢大鼠，正常對(duì)照組大鼠正常對(duì)照組肺臟表面光滑、無(wú)出血點(diǎn)、質(zhì)軟。小通氣量模型組大鼠肺臟點(diǎn)狀出血或小片狀出血、質(zhì)軟。大通氣量模型組大鼠肺臟黑褐色或鮮紅色、腫大、大片狀出血或全肺出血。光鏡下200 倍所見(jiàn)如中插彩版圖1。

3 討論

暴喘癥病因復(fù)雜，有100 多種疾病可并發(fā)暴喘癥，但大致可分為直接原因和間接原因兩大類，分別為肺源性暴喘癥和肺外源性暴喘癥。據(jù)此，動(dòng)物模型亦可分為肺內(nèi)型和肺外型。其中肺內(nèi)型包括鹽酸吸入型，從氣管內(nèi)注入0.1 mL 鹽酸（1 mL/kg）可使麻醉后動(dòng)物發(fā)生ALI（急性肺損傷）。鹽酸吸入肺模型常被用作吸入性肺炎的試驗(yàn)研究，研究表明[2-3]，向家兔氣管注入鹽酸后，引起肺泡-毛細(xì)血管膜損傷。鹽酸也可損傷PS（肺表面活性物質(zhì)）系統(tǒng)，出現(xiàn)暴喘癥的臨床特征。實(shí)際上，此種模型雖然循環(huán)功能穩(wěn)定，但組織損傷基本局限于肺部，是對(duì)胃內(nèi)容物的誤吸所致ALI 的模擬，而不足于切實(shí)形成暴喘癥模型。Hare 等（1999）給兔氣管內(nèi)分別滴入人乳、鹽酸酸化后的人乳建立了ALI 模型，與單純鹽酸吸入所致的ALI 模型比較，在炎性介質(zhì)、病理改變等方面無(wú)明顯差別。另一種肺內(nèi)型為機(jī)械通氣相關(guān)肺損傷，用20 mL/kg 的潮氣量、85 次/min 的呼吸頻率，2 h 可誘發(fā)大鼠的肺損傷[4]。其致病機(jī)制在于肺組織的過(guò)度膨脹造成的血管透壁壓和滲透性增加，大致包括加劇炎性反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、改變腎性細(xì)胞核苷酸和嘌呤受體的表達(dá)幾個(gè)方面，焦點(diǎn)在于是否有炎性因子參與肺損傷及參與的程度[5]。總之，機(jī)械通氣導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)及神經(jīng)體液系統(tǒng)的改變?cè)诒┐Y的發(fā)生中起著重要作用。目前另有報(bào)道[6]說(shuō)明機(jī)械通氣是治療暴喘癥的重要手段，目前常采用低潮氣量（6 mL/kg）的機(jī)械通氣模式，已有多項(xiàng)研究表明可能更加有利于暴喘癥患者的恢復(fù)。因此，采用機(jī)械通氣用于動(dòng)物模型的制備時(shí)，準(zhǔn)確把握機(jī)械潮氣量是重點(diǎn)和難點(diǎn)。

在臨床上，誤吸導(dǎo)致急性肺損傷的影響因素甚多，形成機(jī)制比較復(fù)雜。鹽酸作為一種強(qiáng)酸性化學(xué)物質(zhì)，對(duì)肺可產(chǎn)生直接的損害，使肺泡上皮和肺毛細(xì)血管通透性增加，發(fā)生出血、壞死、淤血等病理改變，可作為對(duì)胃內(nèi)容物的誤吸所致暴喘癥的模擬[7]。

綜上所述，本研究成功建立了誤吸造成的暴喘癥大鼠模型。將鹽酸作為造模藥模擬臨床胃內(nèi)容物誤吸造成的暴喘癥，同時(shí)聯(lián)合機(jī)械通氣，使動(dòng)物出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，改變以往主要通過(guò)單純鹽酸吸入、鹽酸酸化后人乳滴入等方式制備誤吸的急性肺損傷模型，損傷局限于肺部，難以造成呼吸窘迫程度的情況，更具可行性和穩(wěn)定性，從而涉及更廣范圍的誤吸病人，也更接近于臨床實(shí)際，通過(guò)成功建立誤吸造成的暴喘癥大鼠模型，為進(jìn)一步開(kāi)展誤吸造成的暴喘癥研究提供工作平臺(tái)。

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