急性熱應激對鵝血清激素水平及肝臟HSP70 基因表達的影響

仲慶振，王 丹，孫澤威，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

作為動物應激反應的主要調(diào)控物質(zhì)，促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺素、胰高血糖素、生長激素等被稱為“應激激素”，并被作為評價機體應激反應強度的客觀指標[1]。熱應激蛋白70（Heat stress proteins 70，HSP70），可調(diào)節(jié)細胞的生理功能，提高細胞對應激源的耐受性[2]。因此，在受到應激刺激時，細胞能否適時產(chǎn)生足量的HSP70 是細胞功能狀態(tài)和抗應激能力良好的重要生物學標志[3]。

本試驗通過放射免疫和實時熒光定量PCR 技術，測定鵝不同時間急性熱應激處理血清激素水平和肝臟HSP70 mRNA的表達變化，揭示鵝在急性熱處理下鵝應激指示激素和肝臟HSP70 mRNA的動態(tài)變化規(guī)律，為判斷鵝的熱應激狀態(tài)和研究鵝的耐熱機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計 選取1 日齡健康仔鵝60 只，隨機分成6 組，每組10 只，單籠飼養(yǎng)在環(huán)控倉內(nèi)，自由采食及飲水。隨著日齡的增長，逐漸將環(huán)境溫度下調(diào)至（22±1）℃。待飼養(yǎng)至8 周齡時，對照組仍置于（22±1）℃環(huán)境中，其余各組鵝突然施于2、4、6、8 h 和10 h（40±1）℃（相對濕度65%）的高溫處理，各組處理均在16：00 結(jié)束。

1.2 樣品采集 處理結(jié)束后，試驗鵝全部屠宰取全血，室溫靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min 分離血清，-20 ℃保存、待測；取100 mg 左右肝臟迅速投入液氮速凍后置-80 ℃保存待測。

1.3 激素測定 INS、COR、T3、T4的含量采用放射免疫分析法，按試劑盒的說明書進行測定，γ放射免疫計數(shù)器為中國科大中佳公司GC-2016 型。

1.4 肝臟HSP70 mRNA測定

1.4.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 利用TRIZol 試劑盒提取總RNA后，使用SYBR ExScriptTMRTPCR Kit（寶生物工程（大連）有限公司）試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。

1.4.2 引物設計 根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝HSP70基因序列（序列號：EU680475）和GAPDH 基因序列（序列號：DQ821717），利用Primer Premier 5.0軟件設計兩對引物，HSP70 F：5′-GGAGACAAGTCCGAGAAT-3′，HSP70 R：5′-GGAGGGATGCCTGTTAGA-3′；GAPDHF：5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTCAT-3′，GAPDH-R：5′-CCCTCCACAATGCCAAAGTT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4.3 實時熒光定量PCR 檢測 熒光實時定量PCR在美國產(chǎn)ABI7000 熒光定量分析儀上進行。PCR 反應體系為20 μL，反應液配比為：cDNA模板1.0 μL，上游引物、下游引物各0.4 μL，PremixEx Taq10 μL，滅菌蒸餾水7.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL。反應條件是：95 ℃預變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。所有樣品檢測均設1 個平行樣和1 個無模板的陰性對照以排除假陽性結(jié)果。獲得HSP70 標準方程為：Y=-3.5846Log（X）+27.2794，相關系數(shù)為R2=0.9693；內(nèi)參GAPDH 標準方程為：Y=-3.5086Log（X）+23.8604，相關系數(shù)為R2=0.9679?！鰿t（CtHsp70-CtGAPDH）與模板倍比稀釋濃度的線性方程為：Y=0.018X+3.406，斜率接近0，說明HSP70 mRNA和內(nèi)參GAPDH 具有相似的擴增效率，可以應用2-△△Ct法對測定結(jié)果進行計算分析。

1.5 統(tǒng)計分析 對試驗所獲得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析和duncan′s 多重比較，數(shù)值以±SD的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 急性熱應激對仔鵝血清幾種激素水平的影響 如表1 所示，2 h 熱應激處理并未對血清INS水平造成顯著影響；從熱應激4 h 開始，鵝血清INS水平顯著下降（P＜0.05），此后隨熱應激時間延長未再出現(xiàn)顯著變化。仔鵝血清COR 濃度從熱應激4 h 后開始顯著性升高（P＜0.05），但熱應激處理4、6、8 h 和10 h 之間無顯著差異。仔鵝血清T3濃度在熱應激處理2 h 以后極顯著下降（P＜0.01），熱應激6 h 和8 h 后降至最低水平。血清T4水平在熱應激2 h 后便顯著下降，但到熱應激10 h后又恢復到對照組水平。

表1 急性熱應激條件下仔鵝的血清激素水平

2.2 急性熱應激對仔鵝肝臟HSP70 mRNA水平的影響 如圖1 所示，仔鵝肝臟HSP70 mRNA水平從熱應激2 h 后便開始顯著升高，其中熱應激2、8 h 和10 h 處理組HSP 70 mRNA表達水平相近，均顯著低于熱應激4 h 和6 h 組，上述差異均達到了統(tǒng)計學極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 H SP70mR NA在熱應激處理仔鵝肝臟內(nèi)的表達水平

3 討論

3.1 急性熱應激對鵝血清激素水平的影響 熱應激狀態(tài)下，交感神經(jīng)興奮，腎上腺素和去甲腎上腺素分泌增多，進而抑制胰島素的分泌[4]。本試驗研究結(jié)果證實了這一論點，急性熱應激4 h 可顯著降低仔鵝血清INS水平，但此后再進一步延長熱應激時間并未引起INS水平進一步降低。肉雞熱應激方面的研究也得出了相似結(jié)論，在短期熱應激過程中胰島素下降，而在長期應激過程中胰島素水平呈無規(guī)律變化[5]。許多研究結(jié)果表明，熱應激可顯著提高動物機體COR 水平[6]。本試驗得出相同結(jié)論，仔鵝血清COR 濃度在熱應激4 h 開始顯著升高，但隨時間推移，皮質(zhì)醇含量沒有進一步提高。由于本試驗僅進行10 h 急性熱應激處理，10 h 后鵝血清COR的變化需進一步研究證實。

高溫環(huán)境中，雞通過減少甲狀腺激素分泌降低自身代謝產(chǎn)熱[7]。T3濃度在熱應激條件下會迅速下降，為肉雞熱應激敏感指標；T4受熱應激后也下降，但反應較T3遲緩，可作為熱應激的參考指標[8-9]。本研究中，仔鵝甲狀腺功能對熱應激也表現(xiàn)出了較高的敏感性，T3、T4水平均在熱應激2 h 后便顯著下降，進而降低代謝水平，減少體產(chǎn)熱以維持體熱平衡。但也有研究提出了相反的結(jié)論[10]。

3.2 急性熱應激對仔鵝肝臟HSP70 mRNA水平的影響 本試驗熱應激處理2 h，仔鵝肝臟HSP70 mRNA表達量極顯著升高，比應激前上升3.57 倍，與許友生（2011）[11]研究結(jié)果一致。而王德前（2012）[12]認為，熱應激對蛋鴨肝臟中HSP70 mRNA的表達量沒有影響。這可能與動物品種、熱應激的強度和時間等因素有關。同時本試驗發(fā)現(xiàn)，肝臟HSP70 mRNA水平6 h 升至最高點，8、10 h 低于6 h 水平，這可能因為HSP70 的表達受到負反饋調(diào)控，即高含量的HSP70與HSF結(jié)合并抑制HSF的活性，從而減少HSF和HSE的特異性結(jié)合，控制熱休克基因的進一步轉(zhuǎn)錄，也可能由于機體進行自我保護性的調(diào)節(jié)反應，使機體逐步適應了環(huán)境的變化。

4 結(jié)論

（40±1）℃不同時間長度的急性熱應激處理導致仔鵝生理機能的顯著變化，血清COR含量顯著上升，INS、T3、T4含量顯著下降；熱應激下HSP70 基因的表達受熱應激調(diào)節(jié)，誘導表達的HSP70 使機體獲得了一定的高溫耐受力，對應激起到一定的保護作用。

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