• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      新型鴨呼腸孤病毒S組基因克隆及序列分析

      2015-03-18 07:48:22卿柯香袁遠(yuǎn)華郭霄峰黃淑堅
      中國獸醫(yī)雜志 2015年6期
      關(guān)鍵詞:呼腸核苷酸相似性

      卿柯香,袁遠(yuǎn)華,郭霄峰,黃淑堅

      根據(jù)國際病毒分類委員會第九次報告,正呼腸孤病毒屬依然分3 個亞群:第Ⅰ亞群包括不含融合基因的哺乳動物呼腸孤病毒(Mammalian reoviruses,MRV);第Ⅱ亞群包括具有融合基因的禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)和內(nèi)爾森海灣病毒(Nelson Bay virus,NBV);第Ⅲ亞群包括狒狒呼腸孤病毒(Baboon reovirus,BRV);從蛇分離到的兩株呼腸孤病毒暫且將其歸為第Ⅳ亞群[1-2]。其中禽呼腸孤病毒包含雞源、火雞源、鵝源、番鴨源的呼腸孤病毒。

      新型鴨呼腸孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)病,是一種以肝臟不規(guī)則壞死、出血斑/點和心肌、腔上囊出血為主要特征的新疫病,各品種鴨(如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨等)均可感染發(fā)病。該病病原為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬,一種分節(jié)段的dsRNA病毒[3]。NDRV含有10個RNA片段,即3 個大基因Ll、L2、L3,分別編碼λA、λB、λC3 種蛋白;3 個中基因M1、M2、M3,分別編碼μA、μB和μN(yùn)S5 種蛋白;4 個小基因S1、S2、S3 和S4,分別編碼P10、P18、σC、σA、σB和σNS6 種蛋白[4]。

      本實驗室從臨床病料分離到1 株新型鴨呼腸孤病毒,并命名為NDRV-QY 株[5]。為了解QY 株病毒與其他正呼腸孤病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系,本試驗將QY 株的S組基因核苷酸序列與國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行了比對和分析,以初步明確該株病毒的分類地位。

      1 材料與方法

      1.1 病毒株及工程菌 新型鴨呼腸孤病毒(NDRVQY)、工程菌大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院傳染病室提供。

      1.2 主要試劑 RNAiso Reagent,購自美國Invitrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix ExTaqTMVersion2.0、pMD18-T 載體、DNAMarker(DL-2 000),均購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit(2000)為OMEGA公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

      1.3 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank 中登錄的NDRVS1、S2、S3 和S4 基因序列(JX478256、JF320803、GQ888710、GU338025),用Primer Primer5.0 軟件設(shè)計合成了覆蓋S1、S2、S3 和S4 基因開放閱讀框的多對特異性引物(見表1)。

      表1 引物序列

      1.4 病毒S組基因RT-PCR 擴(kuò)增 按RNAiso Reagent 操作說明書提取病毒總RNA,隨機(jī)引物和AMV反轉(zhuǎn)錄后作為模板,采用見表1 中引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃4 min;94 ℃50 s,55 ℃50 s,72 ℃1 min 20 s;進(jìn)行30 個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠純化與回收PCR 產(chǎn)物,連接至pMD18-T 載體中,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,鋪氨芐抗性LB瓊脂平板37 ℃倒置培養(yǎng),經(jīng)鑒定后挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

      1.5 S組基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列分析利用DNAStar(Version 7.10)軟件對測定的病毒核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列與GenBank 中收錄的正呼腸孤病毒屬成員的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的序列進(jìn)行同源性比對和分析。

      2 結(jié)果

      2.1 S1、S2、S3 基因和S4 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用S組各段基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果與預(yù)期相符。利用DNAStar 軟件進(jìn)行序列拼接,QY 株S1、S2、S3 基因和S4 基因核苷酸編碼區(qū)序列已登錄在GenBank 中,登錄號分別為:KF689545、JQ863359、JQ866923、JQ922269。

      2.2 S組基因編碼區(qū)cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列的比較分析 S1 基因為多順反子,編碼區(qū)全長1 517bp,3 個部分重疊開放性閱讀框(ORF)分別編碼p10 蛋 白(ORF 為294,編 碼97aa),功能未知的p18 蛋白(ORF 為489 bp,編碼162aa)和σC蛋白(ORF 為966 bp,編碼321aa)。DRV-QY 株σC蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為95.5%~97.5%,與MDRV的相似性為51.3%~52.3%,與ARV的相似性只有39.4%~40.9%。氨基酸序列相似性顯示,DRV-QY 株與DRV的氨基酸序列相似性為96.0%~97.2%,與MDRV的相似性為42.6%~43.0%,與ARV的相似性為27.0%~29.9%。

      S2 基因ORF 全長1 251 bp,編碼由416 個氨基酸組成的σA蛋白。DRV-QY 株σA蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為88.1%~99.5%,與MDRV的相似性為85.8%~91.2%,與ARV的相似性為73.3%~74.8%。

      S3 基因ORF 全長1 104 bp,編碼由367 個氨基酸組成的σB蛋白。和氨基酸序列相似性分析表明,DRV-QY 株σB蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為96.6%~98.6%,與MDRV的相似性為66.5%~66.8%,與ARV和TRV的相似性為64.7%~67.6%。氨基酸序列相似性顯示,DRVQY 株與DRV的氨基酸序列相似性為94.8%~98.4%,與MDRV的相似性為68.1%~68.9%,與ARV和TRV的相似性為67.0%~69.2%。

      S4 基因ORF 全長1 104 bp,編碼由367 個氨基酸組成的σNS蛋白。DRV-QY 株σNS蛋白編碼區(qū)核苷酸序列與DRV的相似性為92.9%~99.2%,與MDRV的相似性為83.9%~85.0%,與ARV和TRV的相似性為76.6%~79.1%。

      2.3 QY 株與其他正呼腸孤病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系QY 分離株S組核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析表明,參比序列大致分為3 個亞群,即哺乳動物呼腸孤病毒(MRV)亞群,狒狒呼腸孤病毒(BRV)亞群及禽呼腸孤病毒(ARV)和內(nèi)爾森海灣病毒(NBV)亞群。其中DRV、ARV、TRV、MDRV、NRV位于第二亞群,且NDRV-QY 與新近報道的新型鴨呼腸孤病毒DRV處于進(jìn)化樹的同一小分支,親緣性較近(見圖1)。

      3 分析與討論

      本研究參考新型鴨呼腸孤病毒的S組基因序列設(shè)計特異性引物,對國內(nèi)分離株NDRV-QY 的S組基因編碼區(qū)進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增、克隆及序列測定,表明QY 株S組基因片段所包含的主要ORF 大小分別為1 517 bp、1 251 bp、1 104 bp 和1 104 bp。

      圖1 基因σC、σA、σB和σNS的遺傳發(fā)育樹

      各序列分析結(jié)果表明,QY 株的S組基因各節(jié)段編碼區(qū)和GenBank中已有的ARV、TRV、MDRV、DRV、GRV均有不同程度的同源性,其中與DRV的同源性最高,核苷酸序列和氨基酸序列同源性均達(dá)90%以上,與NBV、BRV、MRV同源性則為9.3%~59.4%,同源性較低。另外,QY 株與DRV、ARV、NBV、MRV的外殼蛋白,σC蛋白是由S1 基因編碼[4,6,7],而MDRV的σC蛋白則是由S4 基因編碼的[8]。MDRV的S4 基因為多順反子,但是QY 株和DRV、ARV、NBV的Sl基因包含3個開放閱讀框(ORF)[4-11]。MDRV的S4基因缺少Q(mào)Y 株S1 的ORF2,不能表達(dá)p18 蛋白。以上結(jié)果表明,QY 株是有別于MDRV和ARV的新型鴨呼腸孤病毒,同時也說明我國家禽尤其是水禽體內(nèi)存在著多種基因類群的呼腸孤病毒。

      根據(jù)QY 株σC、σA、σB和σNS的遺傳進(jìn)化樹分析表明,QY 株與DRV、MDRV、ARV同在正呼腸孤病毒的第Ⅱ亞群,是不同于MDRV和ARV的獨立分支。QY 株與DRV具有很高的同源性且處在同一個分支,提示它們可能來自同一祖先。

      由上述結(jié)果分析可知,NDRV與MDRV、ARV可能具有相同的祖先而進(jìn)化成不同的分支,建議將NDRV歸屬為正呼腸孤病毒屬的第Ⅱ亞群中。

      [1]張云,劉明,歐陽歲東,等.正呼腸孤病毒及其分類學(xué)依據(jù)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(6):46-49.

      [2]張忠信.ICTV第九次報告對病毒分類系統(tǒng)的一些修改[J].病毒學(xué)報,2012,28(5):595-599.

      [3]陳少鶯,陳仕龍,林鋒強(qiáng),等.新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].病毒學(xué)報,2012,28(3):224-230.

      [4]Wang Dan,Xu Feng,Ma Guo-ming,et al.Complete genomic sequence of a newmuscovy duck-origin reovirus from China[J].Journal of Virology,2012,86(22):12445.

      [5]袁遠(yuǎn)華,王俊峰,吳志新,等.1 株番鴨源新型鴨呼腸孤病毒(QY株)生物學(xué)鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2013,33(8):1174-1178.

      [6]Martinez-Costas J,Grande A,Varela R,et al.Protein architec ture of avian reovirus S1133 and identification of the cell attachment protein[J].Journal of Virology,1997,71:59-64.

      [7]Grande A,Costas C,Benavente J.Subunit composition and conformational stability of the oligomeric form of the avian reovirus cell-attachment protein sigma C[J].Journal of General Virology,2002,83:131-139.

      [8]Kuntz-Simon G,Gall-Recule G L,Boisseson C,et al.Muscovy duck reovirus σCprotein is atypically eneoded by the smallest genome segment[J].Journal of General Virology,2002a,83:1189-1200.

      [9]Shapouri MR,Kane M,Letartc M,et al.Cloning,sequencing and expression of the S1 gene of avian reovirus[J].Journal of General Virology,1995,76:1515-1520.

      [10]Bhudevi B,Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for detection and classification of bovine viral diarrhea virus[J].Vet Microbiol,2001,83:1-10.

      [11]Shmulevitz M,Yameen Z,Dawe S,et al.Sequential partially overlapping gene arrangement in the tricistronic S1 genome segments of avian reovirus and Nelson Bay reovirus:implications for translation initiation[J].Journal of Virology,2002,76:609-618.

      猜你喜歡
      呼腸核苷酸相似性
      一類上三角算子矩陣的相似性與酉相似性
      單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
      徐長風(fēng):核苷酸類似物的副作用
      肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
      淺析當(dāng)代中西方繪畫的相似性
      河北畫報(2020年8期)2020-10-27 02:54:20
      Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
      鴨呼腸孤病毒感染的診斷與防治
      簡述豬呼腸孤病毒感染防治
      低滲透黏土中氯離子彌散作用離心模擬相似性
      草魚呼腸孤病毒096 vp4基因生物信息學(xué)分析及其在腎細(xì)胞中的表達(dá)
      番鴨呼腸孤病毒活疫苗的推廣應(yīng)用
      中西区| 聊城市| 漠河县| 瑞昌市| 绥棱县| 西乌珠穆沁旗| 镇江市| 东乌珠穆沁旗| 丹巴县| 辉县市| 奉新县| 海门市| 壤塘县| 施甸县| 莒南县| 内黄县| 四会市| 滦平县| 赤城县| 延庆县| 永兴县| 济宁市| 安塞县| 东明县| 临颍县| 海晏县| 曲沃县| 长沙县| 定边县| 湖南省| 神农架林区| 呈贡县| 合川市| 江城| 汉寿县| 界首市| 云霄县| 长岛县| 灵武市| 金华市| 延安市|