重組IFN-α-IL-18 體外對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及核因子κB 的影響①

楊 惠 李銀聚 劉一塵 程相朝 楊丹芳 韓海鋒 金修哲

(河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003)

雞干擾素α(Chicken interferon，ChIFN-α)是一種重要的免疫細(xì)胞因子，它誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)，并在禽類抵抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)中扮演主要角色［1］。ChIFN-α 不影響機(jī)體細(xì)胞本身的mRNA與核蛋白體的結(jié)合，不妨礙宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)［2］。此外，干擾素還具有廣泛的調(diào)節(jié)功能，參與調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞復(fù)制、增生及機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活［3］。雞白細(xì)胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞因子，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成員［4］，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，能誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖、增強(qiáng)IFN-γ 的分泌，對(duì)MHC Ⅱ類分子的合成也具有正調(diào)節(jié)作用［5］。

核因子kappa B(Nuclear factor kappa-B，NFκB)是由Rel/NF-κB 家族的多肽成員組成的一組轉(zhuǎn)錄因子［6，7］。NF-κB 通常與其抑制蛋白IκB (Inhibitor of NF-κB，IκB)結(jié)合，并以非活性狀態(tài)貯存于細(xì)胞質(zhì)中［8］;當(dāng)細(xì)胞受到如細(xì)菌、細(xì)胞因子等刺激后，NF-κB 以活化的形式進(jìn)入細(xì)胞核［9］，和靶基因上的特異DNA 序列結(jié)合后，對(duì)免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥、腫瘤生成和凋亡在內(nèi)的400 多基因的發(fā)揮中心性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［10］。NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄因子，在生命活動(dòng)中與疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用已得到廣泛的認(rèn)同［11］。

為了便于實(shí)際工作中實(shí)現(xiàn)同時(shí)調(diào)節(jié)抗病毒和免疫增強(qiáng)作用，本實(shí)驗(yàn)將雞的IFN-α-IL-18 基因融合并在畢赤酵母中表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫活性進(jìn)行檢測(cè)，初步研究了雞IFN-α-IL-18 融合蛋白對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NF-κB 表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明IFN-α-IL-18 融合蛋白的功能及作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雞胚、菌株、質(zhì)粒及試劑 SPF 雞胚購(gòu)于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所;重組酵母菌X-33/pPICZ-IL-18 和質(zhì)粒pMD-19T-IFN-α［12］為河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共安全實(shí)驗(yàn)室提供;工具酶、dNTP 等購(gòu)自TaKaRa 公司;DNA 回收和質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物科技有限公司;Zeocin、MTT等購(gòu)自Solarbo 公司;His 小鼠源單克隆抗體及山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自碧云天生物科技研究所;Ni-NTA His·Bind resin 購(gòu)自Merck (Novagen)公司;淋巴細(xì)胞分離液、BCA 蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司;雞NF-κB ELISA Kit 試劑盒購(gòu)自上海圻明生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank (GU119896.1)設(shè)計(jì)2 對(duì)IFN-α 引 物:P1:CGGAATTCAACCACCTTCGCCC;P2:GGCTCTAGAGCAGTGCGAGTGATAAATGTG(劃線部分分別為EcoRⅠ和XbaⅠ位點(diǎn));P3:ACGGTACCAACCACCTTCGCCCCCAG;P4:GAAGATCTATTAGTGCGAGTGATAAATGTGAGG(劃線部分分別為KpnⅠ和BglⅡ位點(diǎn))，由北京六合華大公司合成。

1.3 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ-IFN-α 和pPICZIFN-α-IL-18 的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMD-19T-IFN-α 為模板，以P1、P2 為引物，PCR 擴(kuò)增出帶有EcoRⅠ/XbaⅠ酶切位點(diǎn)的IFN-α 基因片段，經(jīng)EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切載體質(zhì)粒pPICZ-αA 作定向連接，構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ-IFN-α。

以質(zhì)粒pMD-19T-IFN-α 為模板，以P3、P4 為引物，PCR 擴(kuò)增獲得帶有Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切位點(diǎn)的IFN-α 基因片段，經(jīng)KpnⅠ/Bgl Ⅱ雙酶切后，與KpnⅠ/BamHⅠ切除HN 基因的質(zhì)粒pBS SK+-HN-IL-18利用BamHⅠ和BglⅡ同裂酶性質(zhì)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBS SK+-IFN-α-IL-18。分別對(duì)質(zhì)粒pBS SK+-IFN-α-IL-18 和pPICZ-αA 載體質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ/NotⅠ雙酶切，將獲得的IFN-α-IL-18 融合基因和pPICZ-αA 載體片段相互連接，構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pPICZ-IFN-α-IL-18。

1.4 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)和Western blot 檢測(cè) 以電轉(zhuǎn)方法將線性化的重組質(zhì)粒pPICZ-IFN-α 和pPICZ-IFN-α-IL-18 轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)X-33 細(xì)胞，經(jīng)高抗性YPDZ(Zeocin 2 000 μg/ml)篩選，篩選到含有目的基因片段的重組菌X-33/pPICZ-IFN-α和X-33/pPICZ-IFN-α-IL-18。挑取重組酵母X-33/pPICZ-IFN-α、X-33/pPICZ-IFN-α-IL-18 和 X-33/pPICZ-IL-18 及對(duì)照菌X-33/pPICZ-αA 形成的單個(gè)菌落，接種到BMGY 培養(yǎng)液中，30℃，300 r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心棄培養(yǎng)液，沉淀酵母細(xì)胞用等體積的BMMY 培養(yǎng)液重懸，27℃～29℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每24 h 添加甲醇至終濃度為1%，留取不同時(shí)間段的培養(yǎng)液上清，在真空濃縮系統(tǒng)中做2 倍濃縮。SDS-PAGE 檢測(cè)后，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(恒流1 mA/cm，3 h)，清洗后以5 %脫脂奶粉封閉，TBST 和TBS 緩沖液漂洗后，加His 小鼠源單克隆抗體37℃作用3 h，加入山羊抗小鼠IgG(H +L)作用1 h，洗滌后加DAB 反應(yīng)液，于暗處反應(yīng)10～20 min，至目的條帶清晰時(shí)加終止液終止反應(yīng)。

1.5 重組蛋白的純化及定量 采用Ni 柱純化法，按Ni-NTA His·Bind resin 說(shuō)明書(shū)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，并用SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的純化效果，濃縮后用BCA 試劑盒測(cè)定目的蛋白質(zhì)含量。分別將純化后的重組蛋白IFN-α-IL-18、IFN-α 和IL-18 調(diào)整濃度為1.0 mg/ml。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 取10 只SPF 雞胚在無(wú)菌潔凈孵化器中孵化，從所孵化的雛雞中選取健康的雄性雛雞6 只，飼養(yǎng)至9 日齡，無(wú)菌從心臟采血，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。Hank's 液洗滌，2 000 r/min 離心后用含1 %雙抗、10 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液懸浮，取10 μl 細(xì)胞計(jì)數(shù)，按計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度至5.0 × 107ml-1。對(duì)照組加空載體上清200 μl，實(shí)驗(yàn)組加pPICZ-IFN-α-IL-18、pPICZ-IL-18 和pPICZ-IFN-α 各200 μg(200 μl)，37℃，5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，分別取培養(yǎng)0、24、48、72 h 的細(xì)胞，作下一步檢測(cè)。

1.7 促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性檢測(cè) 采用MTT 法，參照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行。取無(wú)菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入上述培養(yǎng)的細(xì)胞50 μl，調(diào)零孔不加細(xì)胞，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)孔。每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加100 μl 二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min，測(cè)定OD570 nm 值。所得數(shù)據(jù)計(jì)算平均值，使用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)中的方差分析法，進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

1.8 淋巴細(xì)胞總蛋白和核蛋白提取 取上述培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，用PBS (pH7.2)稀釋至5.0 × 106ml-1。取200 μl 于離心管，液氮反復(fù)凍融和超聲波處理3 次，破壞細(xì)胞并使細(xì)胞內(nèi)成份釋放，4℃，3 000 r/min 離心20 min。收集上清作為細(xì)胞總蛋白。

核蛋白提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，取上述培養(yǎng)的稀釋至5.0 ×106ml-1的淋巴細(xì)胞200 μl，4℃，1 000 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞，加入200 μl預(yù)冷的提取液A，吹打混勻，置冰上15 min，每隔5 min 吹打混勻一次，均勻后于4℃，15 000 r/min 離心5 min 棄上清，沉淀用PBS 洗滌一次，于4℃，15 000 r/min 離心5 min，沉淀中加入200 μl 預(yù)冷的提取液B，吹打混勻，置冰上40 min，每隔10 min 渦旋振蕩一次，最后4℃，15 000 r/min 離心10 min，快速收集上清作為細(xì)胞核蛋白。

1.9 雞淋巴細(xì)胞總NF-κB 和核NF-κB 檢測(cè) 根據(jù)雞NF-κB ELISA Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品按照900、600、300、150、75 ng/L 這5 個(gè)稀釋梯度進(jìn)行稀釋。加樣時(shí)設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、總NF-κB 和核NFκB 樣品孔，每孔加樣50 μl。37℃溫育30 min，洗板5 次，每孔加酶標(biāo)試劑50 μl，37℃溫育30 min，洗板5 次，每孔加顯色液A、B 各50 μl，37℃顯色10 min，每孔加50 μl 終止液終止。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及各組OD 值。根據(jù)所測(cè)五種濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算雞淋巴細(xì)胞總NF-κB 和核NF-κB 含量。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IFN-α-IL-18 的鑒定 重組質(zhì)粒pPICZ-IFN-α 以EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切，可切出3.6 kb 載體片段和0.5 kb 目的基因(圖1)。對(duì)重組質(zhì)粒pPICZ-IFN-α-IL18 進(jìn)行KpnⅠ/NotⅠ雙酶切，可切出3.6 kb 載體片段和1.0 kb融合基因(圖2)。

2.2 重組菌X-33/pPICZ-αA-IFN-α-IL-18 和X-33/pPICZ-αA-IFN-α 的鑒定 對(duì)X-33/pPICZ-αA-IFNα-IL-18 和X-33/pPICZ-αA-IFN-α 單個(gè)菌落培養(yǎng)物基因組進(jìn)行PCR 鑒定，均擴(kuò)增出0.5 kb 的IFN-α 基因片段(圖3)。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 及Western blot 分析 取誘導(dǎo)后96 h 重組菌X-33/pPICZ-IFN-α、X-33/pPICZ-IL-18 和X-33/pPICZ-IFN-α-IL-18 上清液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，與空載體對(duì)照菌比較，在分子量約為22、23 及43 kD 處有明顯的條帶(圖4A)。經(jīng)Western blot 分析，確證為重組蛋白(圖4B)。

圖1 pPICZ-IFN-α 酶切鑒定Fig.1 Identification of pPICZ-IFN-α by digestion

圖2 pPICZ-IFN-α-IL-18 酶切鑒定Fig.2 Identification of pPICZ-IFN-α-IL-18 by digestion

圖3 重 組 菌 X-33/pPICZ-αA-IFN-α-IL-18 和 X-33/pPICZ-αA-IFN-α 的PCR 鑒定Fig.3 PCR identification of X-33/pPICZ-αA-IFN-α-IL-18 and X-33/pPICZ-αA-IFN-α

圖4 重組酵母發(fā)酵液上清中表達(dá)產(chǎn)物IFN-α、IL-18 以及IFN-α-IL-18 的SDS-PAGE 和Western blot 分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant IFN-α，IL-18 and IFN-α-IL-18 expression after retransformation

圖5 重組雞IFN-α-IL-18 對(duì)雞淋巴細(xì)胞生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Activation of chicken IFN-α-IL-18 to stimulated lymphocyte

2.4 雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果 用MTT 法測(cè)定酵母培養(yǎng)液對(duì)體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，誘導(dǎo)前，各組與空白對(duì)照組差別不大。培養(yǎng)24、48、72 h 后，IL-18 組和IFN-α-IL-18組均與空白對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.05)，IFN-α組OD 值高于對(duì)照組，在作用48、72 h 時(shí)有顯著差異(P＜0.05，圖5)。表明含IL-18、IFN-α-IL-18 的重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。IFN-α 對(duì)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖也有一定的作用。

2.5 雞淋巴細(xì)胞NF-κB 檢測(cè)分析 用雞NF-κB ELISA Kit 試劑盒檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞上清液的OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD 值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式:y=0.001 4x +0.019 9(y:OD450nm;x:NF-κB 濃度)，計(jì)算各組淋巴細(xì)胞中總NF-κB濃度及核NF-κB 濃度。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 雞淋巴細(xì)胞總NF-κB 的檢測(cè)結(jié)果Fig.6 NF-κB concentration of chicken stimulated lymphocyte

圖7 雞淋巴細(xì)胞核NF-κB 的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 NF-κB concentration of chicken stimulated lymphocyte nucleus

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，誘導(dǎo)前，各組與對(duì)照組的總NFκB 濃度及核NF-κB 濃度皆差別不大。培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)，IL-18 和IFN-α-IL-18 組淋巴細(xì)胞總NF-κB濃度均與對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.05)，IFN-α組總NF-κB 濃度高于空白對(duì)照組，僅72 h 后差異顯著(P＜0.05，圖6)。培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)，IL-18、IFN-α-IL-18 組的淋巴細(xì)胞核NF-κB 濃度均與對(duì)照組間存在極顯著差異(P＜0.01)，IFN-α 組48 h、72 h 時(shí)差異顯著(P＜0.05，圖7)。

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)蛋白具有翻譯后的加工、修飾功能，其糖基化修飾程度與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似，且表達(dá)量高，成本較昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)低，表達(dá)產(chǎn)物較易于純化［14］。利用基因重組技術(shù)將不同蛋白的基因融合，通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)出兼具各自功能的蛋白［15，16］。本研究將雞IFN-α-IL-18 融合基因進(jìn)行酵母表達(dá)，表達(dá)的IFN-α-IL-18融合蛋白具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，活化的淋巴細(xì)胞中總NF-κB 和核NF-κB 含量均顯著增加。表明IFN-α-IL-18 促淋轉(zhuǎn)活性與NF-κB 表達(dá)、活化及其核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

IL-18 具有誘生IFN-γ、促進(jìn)T 細(xì)胞增殖分化、增強(qiáng)GM-CSF 的產(chǎn)生及NK 細(xì)胞和CTL 細(xì)胞活性的功能［17］。NF-κB 廣泛存在于各種細(xì)胞，參與免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等多種反應(yīng)物質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控，在細(xì)胞增殖和凋亡中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。NF-κB處于活化與失活的動(dòng)態(tài)變化中。細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB 與IκB 偶聯(lián)形成無(wú)活性的三聚體存在于胞質(zhì)中;當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、病毒等因素刺激下，IκB 發(fā)生磷酸化、泛素化降解，NF-κB 核定位信號(hào)序列暴露，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與特定基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)［18，19］?；罨蟮腘F-κB 與細(xì)胞增殖及凋亡有密切關(guān)系［20，21］。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IFN-α-IL-18 融合蛋白和IL-18 的促淋巴細(xì)胞成熟作用比較明顯(P＜0.05)，淋巴細(xì)胞中總NF-κB(P＜0.05)和核NF-κB(P＜0.01)含量均顯著增加;IFN-α 促淋轉(zhuǎn)活性相對(duì)較弱，在后期對(duì)淋巴細(xì)胞成熟轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出促進(jìn)作用，細(xì)胞中總NF-κB 含量增加不明顯，但核中NF-κB 較非刺激的淋巴細(xì)胞中含量高(P＜0.05)，表明IL-18 及其融合蛋白IFN-α-IL-18 不但能夠誘導(dǎo)NF-κB 的表達(dá)，也能使NF-κB 活化進(jìn)入細(xì)胞核。IFN-α 則主要通過(guò)激活NF-κB 活化進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成熟，盡管激活途徑尚需進(jìn)一步研究，但也佐證了活化的NF-κB 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用［22］。IFN-α-IL-18 融合蛋白與IL-18 和IFN-α 單體相比，在促淋巴細(xì)胞成熟和NF-κB 的表達(dá)、激活和轉(zhuǎn)運(yùn)方面沒(méi)有明顯的變化，但說(shuō)明融合后的生物學(xué)活性沒(méi)有改變，對(duì)于其是否兼具免疫增強(qiáng)和抗病毒兩方面的作用研究仍在進(jìn)行之中。

本研究構(gòu)建的重組IFN-α-IL-18 融合蛋白具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，其作用機(jī)制與NF-κB 表達(dá)及激活NF-κB 相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，這對(duì)進(jìn)一步進(jìn)行IFN-α-IL-18 融合蛋白免疫增強(qiáng)和抗病毒作用的研究具有積極意義。

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