H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的抗原表位預(yù)測及其與HLA-Ⅱ類等位基因的相關(guān)性分析①

劉雪婷 王 珊 張俊艷 劉兆宇 陳惠芳 鄒澤紅 肖蘭艷 及志恒 何 穎 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東省過敏反應(yīng)與免疫重點實驗室/呼吸疾病國家重點實驗室變態(tài)反應(yīng)研究室，廣州 510260)

甲型H7N9 流感病毒是在2013 年3 月在中國東部上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)的一種新型禽流感病毒［1］，感染該病毒將引起肺炎、呼吸道衰竭、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［2］。截止到2014 年6 月11日，全國共報告感染H7N9 禽流感的患者共有434例，其中有165 人死亡，死亡率達38%。

甲型流感病毒顆粒外膜由兩型表面糖蛋白覆蓋，一型為血細胞凝集素(Hemagglutinin，HA)，一型為神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)。HA 蛋白的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素。NA 蛋白在決定病毒毒力和宿主特異性方面也具有重要作用，與HA 共同成為流感病毒亞型分型的主要依據(jù)，NA 同時也是抗流感病毒的重要作用靶點［3］。甲型流感能不斷引起流行是由于其抗原性不斷發(fā)生漂移，使流感病毒逃過人體免疫系統(tǒng)的識別［4］，其中最重要是HA 和NA的變異［5］，因此可以通過針對HA 和NA 的表位疫苗技術(shù)來解決這一問題。表位預(yù)測是表位疫苗設(shè)計的前提，本研究采用生物信息學(xué)方法，分析了H7N9流感病毒的28 種HA、24 種NA 的氨基酸序列的同源性，預(yù)測HA 和NA 蛋白的T 細胞和B 細胞相關(guān)抗原表位，為新型H7N9 流感疫苗的制備提供依據(jù)。

人類白細胞抗原(HLA)是位于人類第6 號染色體短臂上的一組緊密連鎖的基因群，是目前已知人體中最具多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)［6］。HLA 系統(tǒng)在不同民族種族和地區(qū)間分布不同，是機體對疾病易感的主要遺傳成分，即擁有不同的HLA 等位基因是導(dǎo)致個體間免疫應(yīng)答能力和對疾病易感性出現(xiàn)差異的主要遺傳學(xué)原因［6］。同時，HLA 是人體特異性免疫系統(tǒng)的一道重要屏障，HLA 分子提呈侵入人體的抗原呈遞給T 細胞，進行抗原清除。HLA 和T 細胞及相關(guān)細胞因子在介導(dǎo)病毒感染人體中發(fā)揮極其重要的作用［7］。本研究預(yù)測HLA-DRB1* 0701 等位基因與HA 和NA 有較強結(jié)合力，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫和文獻公布的該基因在不同地域人群中的基因頻率，推測對H7N9 病毒敏感的人群，以便更有效、及時地控制H7N9 流感的傳播。

1 材料與方法

1.1 HA 和NA 氨基酸序列的獲得及同源性分析從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)網(wǎng)站下載甲型H7N9 流感病毒的28 種HA 和24 種NA 的氨基酸序列，用ClustalX 軟件進行多序列比對，用MEGA4.0 的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建進化樹。根據(jù)序列比對分析結(jié)果，選取其中HA、NA 蛋白代表性的序列作為基準(zhǔn)序列，用于后續(xù)的B 細胞抗原表位、T 細胞抗原表位預(yù)測以及對H7N9 易感人群的預(yù)測。

1.2 HA 和NA 蛋白的B 細胞抗原表位預(yù)測 應(yīng)用DNAStar 軟件中的Protean 模塊分析HA、NA 蛋白的基準(zhǔn)序列，根據(jù)Kyte-Doolittle 方案預(yù)測其親水性［8］;根據(jù)Karplus-Schulz 方案預(yù)測其柔韌性;根據(jù)Emini 方案預(yù)測其表面可及性［9］;根據(jù)Jameson-Wolf 方案預(yù)測其抗原性指數(shù)［10］，確定HA 和NA蛋白基準(zhǔn)序列的B 細胞抗原表位。選取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原性指數(shù)高的區(qū)域作為候選表位，并兼顧二級結(jié)構(gòu)各參數(shù)，避開α-螺旋和β-折疊區(qū)域，確定HA、NA 蛋白的B 細胞優(yōu)勢抗原表位。

1.3 HA 和NA 蛋白的T 細胞抗原表位預(yù)測 使用NetMHC Ⅱ2.2 Server 在線服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)分析26 種MHCⅡ類分子(包括14 種HLA-DR、6 種HLA-DP 和6 種HLA-DQ 等位基因型)與H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的滑動九肽的結(jié)合情況?；瑒? 肽的選取方法為:第1～9 氨基酸序列對應(yīng)的肽段為第1 個九肽，第2～10 氨基酸序列對應(yīng)的肽段為第2 個九肽，第3～11 氨基酸對應(yīng)的肽段為第3 個九肽，以此類推?；瑒泳烹呐cHLA 高親和力的閾值為0.64，低親和力的閾值為0.42。與26 種MHCⅡ類分子結(jié)合力大于0.42 的九肽對應(yīng)的氨基酸序列視為是潛在的T抗原表位。

1.4 H7N9 流感病毒與HLA 等位基因相關(guān)性分析及易感人群預(yù)測 利用NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件分析HA、NA 蛋白的滑動九肽與26 種HLA-Ⅱ類分子的結(jié)合情況，篩選出與HA、NA 蛋白的滑動九肽具有高親和力(親和指數(shù)大于0.64)的HLA-Ⅱ類分子等位基因型，攜帶這些HLA 等位基因的人群可能是對H7N9 病毒存在高的免疫反應(yīng)性的易感人群。

從等位基因頻率數(shù)據(jù)庫(http://www.allele-frequencies.net/)查詢與HA、NA 蛋白具有高親和力的HLA 等位基因在亞洲不同國家的基因頻率，并通過文獻驗證，根據(jù)HLA 等位基因頻率推測H7N9 流感病毒更有可能在哪些國家爆發(fā)。

2 結(jié)果

2.1 HA、NA 蛋白的氨基酸比較 經(jīng)過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同甲型H7N9 流感病毒株之間氨基酸序列相對保守，且28 種HA 以及24 種NA 氨基酸序列可以分為兩個大的族群(圖1A、B)。分別選取兩種蛋白的兩個族群中較有代表性的HA 氨基酸序列ABI84694.1 與AEK84761.1 和NA 氨基酸序列AFX85263.1 與AFU25736.1 為基準(zhǔn)序列以便進行下一步的細胞抗原性表位預(yù)測。

圖1 H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的同源性分析Fig.1 Phylogenetic tree of HA and NA proteins in novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

圖2 HA、NA 蛋白的B 細胞表位預(yù)測Fig.2 Prediction of B cell epitopes on HA and NA proteins of novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

2.2 HA、NA 蛋白的基準(zhǔn)序列的B 細胞抗原性預(yù)測 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，HA 氨基酸序列ABI84694.1 與AEK84761.1 的B 細胞表位預(yù)測結(jié)果并沒有明顯差別，同 樣，NA 氨 基 酸 序 列 AFX85263.1 與AFU25736.1 的B 細胞表位預(yù)測結(jié)果也沒有明顯差別，因此只選取HA 氨基酸序列ABI84694.1 和NA 氨基酸序列AFX85263.1的結(jié)果列出。通過DNAStar軟件的Protean 模塊對HA 和NA 蛋白的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原性指數(shù)進行預(yù)測。取親水性高、柔韌性好、表面可及性大、抗原性指數(shù)高的區(qū)域，綜合選取至少2 個上述參數(shù)較好的重疊區(qū)域，并兼顧二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，選取無規(guī)卷曲區(qū)域，獲得B細胞的抗原表位區(qū)域。從圖2A 綜合各參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在HA 蛋白中63-70、98-117、173-185、195-207、217-238、306-322、332-341、363-429、443-475、492-512 各項指數(shù)均較高，提示可能是抗原性表位;從圖2B 綜合各參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在NA 蛋白中1-9、57-60、97-105、137-141、143-150、162-168、210-215、219-222、258-263、273-280、310-323、415-425 各項指數(shù)均較高，提示為抗原性表位。

圖3 H7N9 流感病毒HA、NA 蛋白的T 細胞表位預(yù)測Fig.3 Prediction of T cell epitopes on HA and NA proteins of novel avian-origin influenza A (H7N9)virus

2.3 HA、NA 蛋白基準(zhǔn)序列的T 細胞抗原性預(yù)測 使用NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件預(yù)測了基準(zhǔn)株HA(ABI84694.1)、NA(AFX85263.1)蛋白的HA、NA 蛋白的滑動九肽與26 種HLA-Ⅱ類分子結(jié)合力，結(jié)合力大于0.42 的滑動九肽對應(yīng)的氨基酸序列為T 抗原表位。軟件預(yù)測結(jié)果顯示，HA 蛋白中第13、24-29、87-89、116、133-183、202-204、225、241-268、290-303、317-324、338-341、377、401-438、510、527-546 滑動九肽對應(yīng)的氨基酸區(qū)段與26 種HLA-Ⅱ類分子結(jié)合力較高(圖3A);NA 蛋白中第7、61-67、92、132-133、156、244-262、310、375-377、420-438 滑動九肽對應(yīng)的氨基酸區(qū)域與26 種HLA-Ⅱ類分子結(jié)合力較高(圖3B)，可能為T 細胞抗原性表位。

2.4 H7N9 流感病毒與HLA 等位基因相關(guān)性分析及易感人群預(yù)測 根據(jù)NetMHCⅡ2.2 Server 在線軟件預(yù)測的HA、NA 蛋白的滑動九肽與26 種HLA-Ⅱ類分子結(jié)合情況，我們篩選出與HA 蛋白的多個滑動九肽具有高親和力的HLA 等位基因DRB1*0701、DQA1 * 0501-DQB1 * 0301、DPA1 * 0103-(DPB1* 0301/DPB1* 0401)(表1)以及與NA 蛋白的多個滑動九肽具有高親和力的HLA 等位基因DRB1* 0701、DRB1* 0101(表2)，攜帶這些等位基因型的人群可能是H7N9 流感病毒的易感人群，尤其是DRB1* 0701 等位基因，與HA、NA 蛋白的多個滑動九肽具有高親和力。

根據(jù)HLA 等位基因頻率數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果，結(jié)合文獻驗證，我們發(fā)現(xiàn)DRB1* 0701 在烏魯木齊維吾爾族人群基因頻率為16.7%，在哈爾濱滿族人群基因頻率為12.8%，在山東漢族人群基因頻率為11.2%，在遼寧漢族人群基因頻率為10.7%，在北京、石家莊、天津漢族人群基因頻率為9.5%，均屬于高頻率等位基因型，提示H7N9病毒在這些地區(qū)的危險性較高;在中國廣東、云南、臺灣地區(qū)漢族人群基因頻率分別為5.7%、4.1%、2.8%;在日本、韓國人群中的基因頻率分別為6.7%、0.3%(表3)。

表1 HA 蛋白的滑動九肽與HLA-Ⅱ等位基因的結(jié)合情況分析Tab.1 Analysis of affinity between peptides of HA protein and HLA-Ⅱalleles by NetMHCⅡ2.2 Server

表2 NA 蛋白的滑動九肽與HLA-Ⅱ等位基因的結(jié)合情況分析Tab.2 Analysis of affinity between peptides of NA protein and HLA-Ⅱalleles by NetMHCⅡ2.2 .Server

表3 DRB1* 0701 在亞洲不同地區(qū)的頻率Tab.3 Frequency of DRB1* 0701 in different countries in Asia

3 討論

近年來隨著生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，生物信息學(xué)軟件已成為預(yù)測抗原表位的有力工具。國內(nèi)外不少學(xué)者都在生物信息學(xué)方法預(yù)測的基礎(chǔ)上進行抗原表位的研究。通過生物信息學(xué)軟件的預(yù)測可極大地提高表位篩選的成功率，減少實驗工作量，節(jié)省研究時間。

理想的抗原表位最好能兼有B 細胞表位與T細胞表位的功能［28］。一方面可以通過刺激B 細胞產(chǎn)生針對抗原的特異性抗體，直接與病毒結(jié)合。同時又可以與MHCⅡ類分子結(jié)合，遞呈到抗原遞呈細胞表面，引發(fā)T 細胞的活化，產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答并能為B 細胞產(chǎn)生抗體提供幫助。本研究利用軟件對H7N9 流感病毒的HA、NA 蛋白的基準(zhǔn)序列的B 細胞和T 細胞抗原表位進行預(yù)測，HA 具有10 個B 細胞表位和15 個T 細胞表位;NA 有12 個B 細胞表位和9 個T 細胞表位，可以作為檢測以及疫苗研發(fā)的靶區(qū)域。但是細胞抗原性表位預(yù)測仍然不夠完善，目前幾乎所有的細胞抗原性表位預(yù)測的算法都是預(yù)測連續(xù)氨基酸組成的線性表位，而較少涉及構(gòu)象性表位的研究。本研究僅是對新型H7N9 流感病毒的HA 和NA 蛋白的細胞抗原性表位進行初步篩選，預(yù)測結(jié)果需要進一步用實驗結(jié)果來證實。

HLA 的Ⅰ類和Ⅱ類基因在人類基因組中多態(tài)性最為豐富，其產(chǎn)物主要具有提呈抗原、激活效應(yīng)T細胞的功能。它們本身多形異質(zhì)型以及參與免疫應(yīng)答，因此具有HLA-Ⅱ某些基因的人群對某些免疫疾病有易感性［29］。影響HLA 基因易感性的因素很多，包括種族的不同和地域的差異。本研究利用NetMHCⅡ2.2 Server 軟件分析與H7N9 流感病毒的HA、NA 蛋白具有高親和力的HLA 等位基因為DRB1* 0701，并根據(jù)該基因在亞洲不同國家的基因頻率，預(yù)測H7N9 病毒可能的易感人群。

［1］Gao R，Cao B，Hu Y，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9)virus［J］.N Engl J Med，2013，368(20):1888-1897.

［2］Li Q，Zhou L，Zhou M，et al.Preliminary report:epidemiology of the avian influenza A (H7N9)outbreak in china［J］.N Engl J Med，2014，370(6):520-532.

［3］Trachtenberg E，Vinson M，Hayes E，et al.HLA class I (A，B，C)and class II (DRB1，DQA1，DQB1，DPB1)alleles and haplotypes in the Han from southern China［J］.Tissue Antigens，2007，70(6):455-463.

［4］Hajjar LA，Schout D，Galas FR，et al.Guidelines on management of human infection with the novel virus influenza A (H1N1)--a report from the hospital das clinicas of the university of sao paulo［J］.Clinics (Sao Paulo)，2009，64(10):1015-1024.

［5］Wu CY，Yeh YC，Chan JT，et al.A VLP vaccine induces broadspectrum cross-protective antibody immunity against H5N1 and H1N1 subtypes of influenza A virus［J］.PLoS One，2012，7(8):e42363.

［6］Mangalam AK，Taneja V，David CS.HLA class II molecules influence susceptibility versus protection in inflammatory diseases by determining the cytokine profile［J］.J Immunol，2013，190(2):513-518.

［7］Foucault ML，Moules V，Rosa-Calatrava M，et al.Role for proteases and HLA-G in the pathogenicity of influenza A viruses［J］.J Clin Virol，2011，51(3):155-159.

［8］Kyte J，Doolittle RF.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein［J］.J Mol Biol，1982，157(1):105-132.

［9］Karplus PA，Schulz GE.Substrate binding and catalysis by glutathione reductase as derived from refined enzyme:substrate crystal structures at 2 A resolution［J］.J Mol Biol，1989，210(1):163-180.

［10］Jameson BA，Wolf H.The antigenic index:a novel algorithm for predicting antigenic determinants［J］.Comput Appl Biosci，1988，4(1):181-186.

［11］Mizuki N，Ohno S，Ando H，et al.Major histocompatibility complex class II alleles in an Uygur population in the Silk Route of Northwest China［J］.Tissue Antigens，1998，51(3):287-292.

［12］Zhou L，Lin B，Xie Y，et al.Polymorphism of human leukocyte antigen-DRB1，-DQB1，and -DPB1 genes of Shandong Han population in China［J］.Tissue Antigens，2005，66(1):37-43.

［13］劉利民，梁健，宋芳吉，等.應(yīng)用SSP-PCR/SSO 方法進行中國遼寧漢族人HLA-DRB1 基因的遺傳多態(tài)性研究［J］.遺傳，1999，21(3):720-737.

［14］Yang G，Deng YJ，Hu SN，et al.HLA-A，-B，and -DRB1 polymorphism defined by sequence-based typing of the Han population in Northern China［J］.Tissue Antigens，2006，67(2):146-152.

［15］Yao Y，Shi L，Shi L，et al.Distribution of HLA-A，-B，-Cw，and -DRB1 alleles and haplotypes in an isolated Han population in Southwest China［J］.Tissue Antigens，2009，73(6):561-568.

［16］Shi L，Xu SB，Ohashi J，et al.HLA-A，HLA-B，and HLA-DRB1 alleles and haplotypes in Naxi and Han populations in southwestern China (Yunnan province)［J］.Tissue Antigens，2006，67(1):38-44.

［17］Hong SC，Lin L，Lo B，et al.DQB1* 0301 and DQB1* 0601 modulate narcolepsy susceptibility in Koreans［J］.Hum Immunol，2007，68(1):59-68.

［18］Huh JY，Yi DY，Eo SH，et al.HLA-A，-B and -DRB1 polymorphism in Koreans defined by sequence-based typing of 4128 cord blood units［J］.Int J Immunogenet，2013，40(6):515-523.

［19］Song EY，Park H，Roh EY，et al.HLA-DRB1 and -DRB3 allele frequencies and haplotypic associations in Koreans［J］.Hum Immunol，2004，65(3):270-276.

［20］Lee KW，Oh DH，Lee C，et al.Allelic and haplotypic diversity of HLA-A，-B，-C，-DRB1，and -DQB1 genes in the Korean population［J］.Tissue Antigens，2005，65(5):437-447.

［21］Song EY，Park MH，Kang SJ，et al.HLA class II allele and haplotype frequencies in Koreans based on 107 families［J］.Tissue Antigens，2002，59(6):475-486.

［22］Lai MJ，Wen SH，Lin YH，et al.Distributions of human leukocyte antigen-A，-B，and -DRB1 alleles and haplotypes based on 46，915 Taiwanese donors［J］.Hum Immunol，2010，71 (8):777-782.

［23］Saito S，Ota S，Yamada E，et al.Allele frequencies and haplotypic associations defined by allelic DNA typing at HLA class I and class II loci in the Japanese population［J］.Tissue Antigens，2000，56(6):522-529.

［24］Horiki T，Ichikawa Y，Moriuchi J，et al.HLA class II haplotypes associated with pulmonary interstitial lesions of polymyositis/dermatomyositis in Japanese patients［J］.Tissue Antigens，2002，59(1):25-30.

［25］Kitawaki J，Obayashi H，Kado N，et al.Association of HLA class I and class II alleles with susceptibility to endometriosis［J］.Hum Immunol，2002，63(11):1033-1038.

［26］Itoh Y，Mizuki N，Shimada T，et al.High-throughput DNA typing of HLA-A，-B，-C，and -DRB1 loci by a PCR-SSOP-Luminex method in the Japanese population［J］.Immunogenetics，2005，57(10):717-729.

［27］Tanaka T，Ohmori M，Yasunaga S，et al.DNA typing of HLA class II genes (HLA-DR，-DQ and -DP)in Japanese patients with histiocytic necrotizing lymphadenitis (Kikuchi's disease)［J］.Tissue Antigens，1999，54(3):246-253.

［28］Parida R，Shaila MS，Mukherjee S，et al.Computational analysis of proteome of H5N1 avian influenza virus to define T cell epitopes with vaccine potential［J］.Vaccine，2007，25(43):7530-7539.

［29］Bignon JS，Aron Y，Ju LY，et al.HLA class II alleles in isocyanate-induced asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，1994，149(1):71-75.