FPR基因shRNA干擾載體的合成與構(gòu)建

楊華等

摘要：目的 設計并構(gòu)建靶向甲酰肽受體FPR基因的shRNA 慢病毒表達載體并鑒定。方法 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的FPR基因序列，設計合成針對FPR的shRNA序列，構(gòu)建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒載體，并通過測序鑒定。結(jié)果 成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒測序結(jié)果與Genebank 中的FPR cDNA 序列相符。結(jié)論 構(gòu)建FPR基因shRNA干擾載體，為該基因的相關(guān)實驗研究提供載體。

關(guān)鍵詞：FPR基因；載體構(gòu)建

Abstract：Objective To construct and identify FPR shRNA lentiviral vector. Methods Genome sequences of FPR gene was retrieved from Genebank. The shRNA sequences for FPR were synthesized and cloned into PDS019_pL/shRNA/GFP/F to generate shRNA lentiviral vector. The recombinant vectors was identified by sequencing.Results The sequence identified by sequencing were the same as the targeting one. Conclusion The constructed FPR shRNA lentiviral vectors were constructed， which may be used for the further research the role of FPR in the malignant behavior of the cancer.

Key words：FPR； Vector construction

甲酰肽受體（Formyl peptide receptor， FPR）在腫瘤的發(fā)生、演進和轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用。設計并構(gòu)建針對FPR基因的RNA 干擾靶點慢病毒載體，為后續(xù)研究FPR在惡性腫瘤生物學行為中的影響提供基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 PDS019_pL/shRNA/GFP表達載體購自諾百生物科技（上海）有限公司。BsmbⅠ內(nèi)切酶、EcoRI內(nèi)切酶、T4DNA ligase 及GeneRuler DNA Ladder購自Fermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購自Ayxgen公司；大腸桿菌STBL3 菌種購于TaKaRa公司；引物Oligo由Invitrogen公司合成；10×Oligo Annealing Buffer購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1利用在線軟件設計并合成針對人類FPR的基因序列的干擾靶序列。

1.2.2干擾序列退火成雙鏈DNA。在PCR擴增儀上進行退火反應，退火條件：95℃，5 min；72℃，5 min；自然降溫至PCR的Block溫度（25℃）。

1.2.3 PDS019_Pl/shRNA/GFP干擾慢病毒骨架載體經(jīng)BsmbⅠ、EcoRI雙酶切后，按照Axygen膠回收試劑盒說明進行膠回收。純化后的酶切載體進行OD質(zhì)檢并定量。

1.2.4 PCR酶切產(chǎn)物與線性化的干擾骨架載體過夜連接。

1.2.5將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌， 涂板過夜培養(yǎng)后，隨機挑選單菌落，用菌檢PCR方法檢測，然后挑取陽性克隆測序驗證。

2結(jié)果

將陽性表達載體進行DNA序列測定，測序結(jié)果與實驗設計的合成的FPR靶基因序列完全一致。結(jié)果表明，合成的寡核苷酸片段成功插入到慢病毒載體PDS019_Pl/shRNA/GFP中，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達載體構(gòu)建成功，見圖1。

3討論

甲酰肽受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族，由FPR1，F(xiàn)PR2 （FPRL1）和FPR3 （FPRL2）3個成員組成。FPR與激動劑結(jié)合后，能夠觸發(fā)胞內(nèi)信號級聯(lián)參與調(diào)節(jié)血管生成，細胞增殖，防止凋亡等[1-2]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，F(xiàn)PRs可能通過自分泌或旁分泌方式與局部刺激相互作用，在促進血管生成和腫瘤生長方面起到非常重要的作用[3-4]。而且， FPR1可以反式激活EGFR，二者共同作用促進神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的惡性表型[4-5]。FPR在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用越來越備受關(guān)注，有望成為腫瘤治療的新靶點之一。

為進一步研究FPR在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，本實驗以FPR基因為靶基因，應用RNAi技術(shù)，設計3種針對FPR基因的特異性shRNA序列，構(gòu)建3對慢病毒干擾載體，經(jīng)PCR鑒定陽性克隆及DNA測序證實合成的寡核苷酸片段成功插入PDS019_Pl/shRNA/GFP，且插入片段與設計的靶序列一致，因此確定本實驗成功構(gòu)建了3種針對FPR基因RNA干擾靶點慢病毒載體。因此，后續(xù)實驗將利用本實驗成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒以建立穩(wěn)定干擾FPR表達的腫瘤細胞株，為進一步研究FPR在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用及可能的作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Cattaneo F，Guerra G，Ammendola R.Expression and signaling of formyl-peptide receptors in the brain [J].Neurochem Res，2010，35（12）：2018-2026.

[2]Li Y，Cai L，Wang H，et al.Pleiotropic regulation of macrophage polarization and tumorigenesis by formyl peptide receptor-2 [J].Oncogene，2011，30（36）：3887-3899.編輯/張燕