甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶(BvM14-Tpx)基因在原核及真核細(xì)胞中的抗氧化及抗鹽能力分析

趙晨曦，南景東，馬春泉，于 冰，陳思學(xué)，李海英,*

(黑龍江大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室；c.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080)

甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶(BvM14-Tpx)基因在原核及真核細(xì)胞中的抗氧化及抗鹽能力分析

趙晨曦a,b,c，南景東a,b,c，馬春泉a,b,c，于 冰a,b,c，陳思學(xué)a,b,c，李海英a,b,c,*

(黑龍江大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室；c.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080)

甜菜M14品系是在栽培甜菜染色體基礎(chǔ)上附加了野生白花甜菜第9號染色體的單體附加系，具有抗逆、無融合生殖等優(yōu)異特性。在前期工作中，通過RACE技術(shù)獲得了甜菜M14品系硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxinperoxidase,Tpx)編碼基因BvM14-Tpx的cDNA全長，此基因參與各種過氧化物的清除反應(yīng)從而提高植物的抗逆性。構(gòu)建了BvM14-Tpx基因的大腸桿菌表達(dá)體系，對轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌體在H2O2脅迫下的生長曲線進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因菌株比對照菌株提前1 h進(jìn)入生長期，說明BvM14-Tpx基因能夠緩解H2O2對大腸桿菌生長的抑制；同時構(gòu)建了BvM14-Tpx基因的釀酒酵母表達(dá)體系，對H2O2及NaCl脅迫下的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的研究表明，轉(zhuǎn)基因酵母的生長好于對照，說明BvM14-Tpx基因可以提高轉(zhuǎn)基因酵母的抗氧化及耐鹽能力。

甜菜M14品系；硫氧還蛋白過氧化物酶；大腸桿菌；釀酒酵母

0 引 言

硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,Tpx)，是過氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族的一員[1]，它由于缺少催化反應(yīng)所需的金屬離子輔基，而具有1-2個保守的Cys殘基，可以代替金屬離子輔基功能，參與各種過氧化物的清除反應(yīng)從而提高植物的抗逆性[2]。同時，它可能是活性氧(ROS)代謝中的重要環(huán)節(jié)，其酶活可能是以巰基為電子供體，還原過氧化氫及氫過氧化物，并參與DNA合成、基因表達(dá)等。硫氧還蛋白過氧化物酶是一類在N端序列至少有一個和過氧化物底物作用的保守半胱氨酸巰基過氧化物酶[3-5]。

甜菜M14品系是通過遠(yuǎn)緣雜交在栽培甜菜(BetavulgarisL.)染色體基礎(chǔ)上附加了野生白花甜菜(B.corollifloraZoss.)第9號染色體的單體附加系，具有野生白花甜菜的一些優(yōu)良性狀，如抗逆、無融合生殖等，由于克服了野生白花甜菜復(fù)雜的遺傳背景，甜菜M14品系是挖掘野生優(yōu)異基因資源的良好材料[6-9]。

本研究以甜菜M14品系為植物材料，以前期通過二倍體栽培甜菜與野生白花甜菜花器官的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析所獲得的差異蛋白質(zhì)信息為基礎(chǔ)，通過RACE技術(shù)獲得了甜菜M14品系編碼硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxinperoxidase,Tpx)基因BvM14-Tpx的cDNA全長；構(gòu)建了原核及釀酒酵母真核過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌及釀酒酵母菌中，檢測轉(zhuǎn)基因工程菌株在H2O2及NaCl脅迫下的生長曲線，對甜菜BvM14-Tpx的抗氧化及抗鹽能力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料、菌種和試劑

1.1.1 植物材料

甜菜M14品系 (Chromosome 9 monosomic addition line ofBetacorollifloraZoss.inBetavulgarisL.，VV+C9，2n=18+1)，其染色體組成中除了包含18條栽培甜菜染色體外，還附加有白花甜菜第9號染色體，種植于黑龍江大學(xué)植物園。

1.1.2 菌種

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和BL21(DE3)菌株，原核表達(dá)載體pET28a，釀酒酵母INVSc1以及真核表達(dá)載體pYES2(由黑龍江大學(xué)魯振強副教授饋贈)。

1.1.3 試劑

pMD20-T Vector Kit、RNA PCR Kit、DNA marker、Protein Marker D530S(TIANGEN)、Agarose Gel DNA Purification Kit、RNaseA、pMD 20-T Vector TA克隆載體試劑盒、ExTaq酶等試劑均購自TaKaRa公司；DNA連接酶購自Promega、實驗所需限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB，其它常規(guī)試劑及藥品均購自Sigma 及科密歐等公司。

1.2 試驗方法

1.2.1BvM14-Tpx基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)甜菜BvM14-Tpx基因序列設(shè)計引物：

NdeIs：5′-GCGCATATGTCATCACTCATT-TTCTCTCTCA -3′；XhoIas：5′- GCGCTCGAGCAAGGCTTTGAGGATTTC -3′

兩個引物分別帶有NdeI和XhoI酶切位點，以甜菜cDNA為模板，擴增BvM14-Tpx基因的完整ORF序列。將純化后的PCR產(chǎn)物與載體pET28a同時進(jìn)行NdeI和XhoI雙酶切后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-BvM14-Tpx。將重組質(zhì)粒pET28a -BvM14-Tpx及空載體pET28a采用熱激法[10]轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。

1.2.2 H2O2脅迫下轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因大腸桿菌生長曲線的測定

挑取含有重組載體pET28a-BvM14-Tpx的E.coliBL21(DE3)的單菌落及含有空載體pET28a的單菌落，分別接種于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基(Kan 50 mg/L)的試管中，37 ℃，180 r/min，活化。將活化后的菌液按照1%的量接種到含有100 mL LB液體培養(yǎng)基(Kan 50 mg/L)的培養(yǎng)瓶中，37 ℃，180 r/min，每隔1 h取樣，測定600 nm下的吸光值，繪制正常條件下的生長曲線。

根據(jù)H2O2濃度梯度試驗確定H2O2脅迫終濃度為3 mmol/L，依照上述活化方法將活化后的菌株擴培3 h后加入IPTG(終濃度0.5 mmol/L)，誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h。將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液按照1%的量結(jié)種到含有100 mL LB液體培養(yǎng)基(Kan 50 mg/L，0.5 mmol/L IPTG及3 mmol/L的H2O2)的培養(yǎng)瓶中，37 ℃，180 r/min，每隔1 h取樣，測定600 nm下的吸光值，繪制H2O2脅迫下轉(zhuǎn)重組載體pET28a-BvM14-Tpx及轉(zhuǎn)空載體pET28a的E.coliBL21(DE3)菌株的生長曲線。

1.2.3BvM14-Tpx基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)甜菜BvM14-Tpx基因序列設(shè)計引物:

HindIIIS：5′-GCGAAGCTTTCATCACTCA-TTTTCTCTCTCA-3′;EcoRIAs：5′-GCGGATTCTTTGAGGATT-TCATCAGCAC-3′

兩個引物分別帶有Hind Ⅲ和EcoR I酶切位點，以甜菜cDNA為模板，擴增BvM14-Tpx基因的完整ORF序列。將純化后的PCR產(chǎn)物與載體pYES2同時進(jìn)行Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-BvM14-Tpx。將重組質(zhì)粒pYES2-BvM14-Tpx及空載體pYES2采用LiAc轉(zhuǎn)化法[11]轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl。

1.2.4 轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因過表達(dá)酵母抗逆性試驗

挑取重組載體pYES2- BvM14-Tpx的釀酒酵母INVScl的單菌落及含有空載體pYES2的單菌落，接種于SC-U液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；測OD600值，調(diào)整5 mL的SC-U液體培養(yǎng)基中的OD600值為0.3；用1 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，接于50 mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)；根據(jù)H2O2及NaCl的濃度梯度脅迫試驗，確定進(jìn)行氧化及鹽脅迫的H2O2及NaCl的終濃度分別為4 mol/L H2O2和1.6 mol/L NaCl；30 ℃培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣，測定600 nm下的吸光值，繪制H2O2及NaCl脅迫下轉(zhuǎn)重組載體pYES2- BvM14-Tpx及轉(zhuǎn)空載體pYES2的釀酒酵母的生長曲線；同時取對照酵母和轉(zhuǎn)基因酵母各1 μL，按照10-1、10-2、10-3、10-4倍數(shù)進(jìn)行稀釋；從各稀釋的酵母菌液中各取5 μL在含有4 mol/L H2O2和1.6 mol/L NaCl的YPD培養(yǎng)基上點板，拍照記錄，研究轉(zhuǎn)基因酵母對于H2O2及NaCl的抗逆性。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因大腸桿菌的獲得

將得到的分別帶有NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切位點的BvM14-Tpx與pET28a片段連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中得到大量復(fù)制。并使用通用引物及特異引物對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選，在陽性植株中提取重組質(zhì)粒載體，進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果見圖1。通用引物及特異引物PCR反應(yīng)獲得的片段大小與預(yù)期大小一致，雙酶切產(chǎn)生的兩條條帶也與預(yù)期得到的條帶大小一致，說明本試驗構(gòu)建pET28a-BvM14-Tpx重組質(zhì)粒載體成功并獲得了轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因大腸桿菌，可以用于下一步進(jìn)行生長曲線的測定。

2.2 氧化脅迫下轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因大腸桿菌的抗性分析

利用紫外分光光度計，分別測定轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因BL21(DE3)菌株及作為對照的轉(zhuǎn)空載體的BL21(DE3)菌株在OD600下的吸光值，繪制成曲線，結(jié)果見圖2。

M1：DL 2 000 DNA Marker；M2：DL 15 000 DNA Marker；1：重組載體的特異引物PCR產(chǎn)物；2：重組載體的通用引物PCR產(chǎn)物；3：重組質(zhì)粒載體的酶切產(chǎn)物圖1 pET28a-BvM14-Tpx重組質(zhì)粒載體的驗證Fig.1 Analysis for pET28a-BvM14-Tpx

圖2 轉(zhuǎn)基因工程菌株生長曲線的繪制Fig.2 Growth cruve of BL21(DE3)transformed with pET28a-BvM14-Tpx

由圖2可知，在正常生長條件下，轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因BL21(DE3)菌株與對照菌株的生長狀況一致(圖2(a))，說明目的基因的轉(zhuǎn)入對菌株的生長無影響；而在3 mmol/L H2O2脅迫下，轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因BL21(DE3)菌株經(jīng)過6 h的適應(yīng)后進(jìn)入對數(shù)生長期，而對照菌株進(jìn)入對數(shù)生長期的時間延遲2 h(圖2(b))，說明BvM14-Tpx基因的轉(zhuǎn)入有助于解除過氧化氫對細(xì)菌生長的抑制。

2.3 轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因釀酒酵母的獲得

將得到的分別帶有XbaⅠ、EcoRⅠ雙酶切位點的BvM14-Tpx與pYES2片段連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中得到大量復(fù)制并采用LiAc轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建成功的真核過表達(dá)載體pYES2-BvM14-Tpx轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，用SC-U培養(yǎng)基培養(yǎng)并利用

特異引物PCR及質(zhì)粒雙酶切篩選陽性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果見圖3。SC-U培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)基因菌株，可見少量白色菌落生長，特異引物PCR反應(yīng)獲得的片段大小與預(yù)期大小一致，雙酶切產(chǎn)生的兩條條帶也與預(yù)期得到的條帶大小一致，結(jié)果表明pYES2-BvM14-Tpx重組載體已成功轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1。

2.4 轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因過表達(dá)酵母抗逆性分析

2.4.1 轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因過表達(dá)酵母在氧化及鹽脅迫下生長曲線的測定

利用紫外分光光度計，分別測定轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因釀酒酵母INVSc1菌株及作為對照的轉(zhuǎn)空載體的釀酒酵母INVSc1菌株在OD600下的吸光值，繪制成曲線，結(jié)果見圖4。

圖3 轉(zhuǎn)pYES2-BvM14-Tpx陽性釀酒酵母的篩選Fig.3 Screening the positive colonies for the recombinant vector pYES2-BvM14-Tpx

圖4 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株生長曲線的繪制Fig.4 The growth cruve of yeast(INVSc1)transformed with pYES2-BvM14-Tpx

由圖4可見，在正常生長條件下，轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因釀酒酵母INVSc1菌株與對照菌株的生長狀況一致(圖4(a))，說明目的基因的轉(zhuǎn)入對菌株的生長沒有影響；而在4 mmol/L H2O2脅迫下，轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因釀酒酵母INVSc1菌株經(jīng)過6.5 h的適應(yīng)后進(jìn)入對數(shù)生長期，而對照菌株無法進(jìn)入對數(shù)生長期(圖4(b))，說明BvM14-Tpx基因的轉(zhuǎn)入有助于解除過氧化氫對細(xì)菌生長的抑制。

2.4.2 轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因過表達(dá)酵母在氧化及鹽脅迫下抗逆能力分析

將轉(zhuǎn)化的酵母在氧化及鹽脅迫培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5 d后觀察酵母的生長狀態(tài)，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，在正常情況下,野生型酵母和轉(zhuǎn)基因酵母長勢

基本一致；而在4 mmol/L H2O2脅迫下，轉(zhuǎn)基因酵母的長勢明顯好于對照組，1.6 mol/L NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因酵母長勢也好于對照。說明BvM14-Tpx基因提高了轉(zhuǎn)基因酵母的耐氧化及鹽脅迫的能力。

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了BvM14-Tpx基因的大腸桿菌表達(dá)體系，以轉(zhuǎn)空載體菌株為對照，對轉(zhuǎn)BvM14-Tpx基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌體在H2O2脅迫下的生長曲線進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因菌株比對照菌株提前1 h進(jìn)入生長期，說明BvM14-Tpx基因能夠緩解H2O2對大腸桿菌生長的抑制。

圖5 轉(zhuǎn)基因酵母耐氧化、鹽脅迫鑒定Fig.5 Oxidation and salt tolerance of transgenic yeast

同時構(gòu)建了BvM14-Tpx基因真核表達(dá)載體，并在釀酒酵母中穩(wěn)定表達(dá)。通過4 mmol/L H2O2及1.6 mol/L NaCl脅迫轉(zhuǎn)基因釀酒酵母，以轉(zhuǎn)空載體菌株為對照，轉(zhuǎn)基因酵母的生長好于對照，說明BvM14-Tpx基因可以提高轉(zhuǎn)基因酵母對于氧化及鹽脅迫的抗性。

本研究表明甜菜M14品系中的BvM14-Tpx基因能夠提高大腸桿菌在H2O2脅迫下的生長能力。而在釀酒酵母中的過量表達(dá)除了能夠提高釀酒酵母對于氧化耐受性外，還發(fā)現(xiàn)BvM14-Tpx基因能夠提高釀酒酵母對于NaCl的抵御能力。說明BvM14-Tpx基因提高了轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的抗氧化及抗鹽性，為進(jìn)一步研究BvM14-Tpx基因?qū)τ谥参锟鼓娣矫娴淖饔玫於嘶A(chǔ)。

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Oxidation resistance and salt resistance analysis ofThioredoxinperoxidase(BvM14-Tpx) gene from Sugar Beet M14 line in transgenic prokaryotic and eukaryotic cells

ZHAO Chen-Xia,b,c，NAN Jing-Donga,b,c，MA Chun-Quana,b,c，YU Binga,b,c，CHEN Si-Xuea,b,c，LI Hai-Yinga,b,c,*

(Heilongjiang Univercity a.College of Life Science;b.Key Laboratory of Molecular Biology of Heilongjiang Province；c.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology，Harbin 150080，China)

Sugar beet monosomic addition line M14 was obtained from the intercross between a cultivated speciesBetavulgarisL. and a wild speciesBetacorollifloraZoss.It contains theBetavulgarisL. genome with the addition of chromosome 9 ofBetacorollifloraZoss.The M14 line has exhibited the characteristics of stress tolerance and apomixes.Previously,a cDNA whole length of theBvM14-Tpxgene which coded for thioredoxin peroxidase was obtained by RACE.It was reported that theTpxgene was involved in the removal of the various peroxide reaction so as to improve the resistance of plants.In this study,theE.coliexpression system ofBvM14-Tpxgene was built.The growth curve ofE.coliBL21 (DE3) bacteria transferringBvM14-Tpxgene was measured under the stress of H2O2.The results showed that transgenicE.colistrains entered growing period 1 h earlier than the control strains,suggesting thatBvM14-Tpxgenes can ease the inhibition of H2O2on the growth ofE.coli.And the eukaryotic expression system ofBvM14-Tpxgene was built.The results of transgenic Saccharomyces cerevisiae under H2O2and NaCl stress,showed that transgenic yeast grown better than the control,suggesting thatBvM14-Tpxcan improve the salt tolerance ability of transgenic yeast.

Sugar Beet M14 line;thioredoxin peroxidase;E.coli;Saccharomyces cerevisiae

10.13524/j.2095-008x.2015.03.048

2015-05-03

國家自然科學(xué)基金資助項目(31471552；31401441)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(C201202)；黑龍江省高校創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)計劃項目(2014TD004)；黑龍江大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊計劃項目(hdtd2010-05)

趙晨曦(1988-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向：植物生物技術(shù)與基因工程;*通訊作者：李海英(1968-)，女，黑龍江肇東人，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：植物生物技術(shù)與基因工程，E-mail：lvzh3000@sina.com。

Q93-331

A

2095-008X(2015)03-0062-06