神經(jīng)纖毛蛋白-腫瘤治療的新靶點(diǎn)

神經(jīng)纖毛蛋白-腫瘤治療的新靶點(diǎn)

楊少君徐衛(wèi)國(guó)

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科河北唐山063000)

[關(guān)健詞]神經(jīng)纖毛蛋白腫瘤治療靶點(diǎn)

[中圖分類號(hào)]R 74

[文章編號(hào)]2095-2694(2015)05-159-5

神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilins，NRPs)最早于1987年被Takagi[1]等人在非洲爪蟾蜍神經(jīng)組織的冰凍切片中發(fā)現(xiàn)。它是一種非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，存在于多種脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中。NRPs家族中包括2名成員：神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin-1，NRP-1)和神經(jīng)纖毛蛋白2(neuropilin2，NRP-2)[2，3]。

NRPs家族兩大成員的不同在于它們配體的特異性。NRP-1是神經(jīng)導(dǎo)向因子(Semaphorins，Sema)3A、3C、3F的受體，而NRP-2更多地與Sema 3B、3C、3D、3F結(jié)合[2，3]。許多研究通過(guò)敲除小鼠的NRPs基因，發(fā)現(xiàn)semaphorin/neuropilin在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中通過(guò)軸突因子發(fā)揮導(dǎo)向作用[4~6]。NRP-1基因突變或缺失的小鼠在胚胎發(fā)育時(shí)期會(huì)出現(xiàn)血管發(fā)育障礙，尤其是神經(jīng)血管、卵黃囊血管網(wǎng)狀組織和主動(dòng)脈弓的發(fā)育，這些心血管方面的異常，將導(dǎo)致胚胎發(fā)育早期死亡，提示NRP-1在血管的生成中起到了重要的作用[7]；NRP-2突變大鼠的特點(diǎn)是淋巴管及微淋巴管發(fā)育異常，表明NRP-2在淋巴管形成中起到不可或缺的作用[8]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)在促血管網(wǎng)絡(luò)的生成中起到極為重要的作用，因此NRPs與VEGF的關(guān)系已然成為研究的熱點(diǎn)。NRP-1可以有效地結(jié)合VEGF165、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(Placenta Growth Factor， PIGF-2):VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E,與此同時(shí)NRP-2是作為VEGF145、VEGF165、PIGF-2、VEGF-C以及VEGF-D的受體[7~10]。

1NRPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在人體內(nèi)，NRP-1和NRP-2定位于不同的染色體,二者有44%的基因同源性，蛋白結(jié)構(gòu)上亦有相似性，分別有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和短的胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即CUB結(jié)構(gòu)域(Complement Binding motifs)，又稱a1/a2結(jié)構(gòu)域、b1/b2結(jié)構(gòu)域、c結(jié)構(gòu)域；其中b1/b2結(jié)構(gòu)域與凝血因子III、IV具有結(jié)構(gòu)同源性，c結(jié)構(gòu)域部分含有甲基蛋白結(jié)合于酪氨酸磷酸酶活性因子(tyrosine phosphatase activity，TPA)μ[11]。a1/a2可以與Sema家族結(jié)合，b1/b2可以與VEGF及Sema結(jié)合，c結(jié)構(gòu)域可以作為二聚化受體[5]。由于NRPs的胞內(nèi)區(qū)域較短，僅含有40個(gè)氨基酸，不含激酶序列，因此胞內(nèi)區(qū)域不能通過(guò)自身介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo)。NRPs的基因均由17個(gè)外顯子組成。NRP-2表達(dá)為選擇性剪接形式，產(chǎn)生兩種亞型,分別為NRP-2a和NRP-2b[3]。

【作者簡(jiǎn)介】楊少軍(1987-)，女，碩士生。研究方向：胃腸腫瘤學(xué)。

【通訊作者】徐衛(wèi)國(guó)。

2NRPs的表達(dá)

2.1胚胎發(fā)育NRPs參多種胚胎組織的發(fā)育，如神經(jīng)組織、骨骼、肌肉、腸黏膜、腎臟、肺、背主動(dòng)脈等[3,12]。敲除NRPs基因的研究提示其在胚胎時(shí)期脈管系統(tǒng)的發(fā)育中起到重要作用，NRP-1主要參與胚胎時(shí)期動(dòng)脈的發(fā)育，而NRP-2主要參與靜脈及淋巴管發(fā)育[8]。

2.2免疫系統(tǒng)體內(nèi)外的相關(guān)研究曾在免疫細(xì)胞如T細(xì)胞亞群及DC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NRP-1的表達(dá)。在免疫環(huán)境中，NRP-1增強(qiáng)了細(xì)胞間相互作用，尤其是調(diào)節(jié)由DC細(xì)胞介導(dǎo)的靜息T細(xì)胞的增殖[7]。NRP-1在鼠科的CD4、CD25陽(yáng)性的T細(xì)胞中表達(dá)，但在天然的T細(xì)胞中不表達(dá)[13]，而且在鼠科T細(xì)胞中的表達(dá)抑制了T細(xì)胞的細(xì)胞增殖[13]。

2.3在人體腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)除了NRPs在腫瘤血管形成過(guò)程中作用的研究之外，NRPs曾被報(bào)道在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，提示NRPs在癌腫形成的過(guò)程有潛在的作用。NRP-1不僅表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而且廣泛表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞中。此外，NRPs在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)通常作為VEGF的受體[14]，作用相當(dāng)于糖蛋白的生長(zhǎng)因子受體。NRP-1曾被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而NRP-2的表達(dá)較少被關(guān)注。事實(shí)上，NRP-2已經(jīng)被證實(shí)表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，如骨肉瘤、黑色素瘤、肺癌、腦部腫瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、粒細(xì)胞白血病、唾液腺囊狀癌、嬰幼兒血管瘤、卵巢癌和膀胱癌等[15~21]。

3NRPs在腫瘤生成中的作用

NRPs的胞內(nèi)序列較短,由44個(gè)氨基酸組成,不含激酶序列,因此不能直接向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)。這就導(dǎo)致與其他膜受體的異二聚化作用需要調(diào)節(jié)NRPs下游信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

3.1NRPs與神經(jīng)叢素及信號(hào)素的作用神經(jīng)導(dǎo)向分子(Semaphorins，Sema)也被稱為信號(hào)素，在種屬結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，研究者將其分為8個(gè)亞型，I型和2型構(gòu)成無(wú)脊椎動(dòng)物的信號(hào)素，3~7型構(gòu)成脊椎動(dòng)物的信號(hào)素[21]。Sema具有兩個(gè)高親和力的受體：NRPs和神經(jīng)叢素(Plexins)。多項(xiàng)研究證明，在胚胎發(fā)育和腫瘤形成過(guò)程中，Plexins是Sema3-NRPs信號(hào)傳導(dǎo)通路中所必須的。Plexins是一級(jí)共受體，與NRPs相同，它也是從非洲爪蟾蜍的神經(jīng)組織分離而出[1],通過(guò)與NRPs的形成的復(fù)合物[22]，在神經(jīng)軸索信號(hào)傳導(dǎo)中有重要的作用[23]。Plexins多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，提示其在腫瘤發(fā)生中起到一定作用[24]。

在人類腫瘤中，Sema經(jīng)常發(fā)生下調(diào)或者突變，促使VEGF與NRPs發(fā)生反應(yīng)。由于等位基因的缺失或啟動(dòng)子的甲基化常導(dǎo)致Sema的滅活，所以Sema被認(rèn)定為一種抑癌基因。敲除染色體3的短臂3p21.3區(qū)域，這個(gè)區(qū)域在肺癌及卵巢癌細(xì)胞中編碼Sema3B 和Sema3F，將導(dǎo)致Sema3B 和Sema3F的缺失[2]。

3.1.1NRPs與Sema3A。NRP-1與Sema介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[25]。在異體移植模型中，Sema3A、 Sema3D、Sema3E和Sema3G的過(guò)表達(dá)可以有效地抑制腫瘤的進(jìn)展，減少腫瘤內(nèi)生血管的數(shù)量，這表明它們有抗血管生成的作用[26]。通過(guò)腫瘤生成的多種小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在致癌作用的晚期抑制Sema可以加速腫瘤血管的生成和腫瘤的進(jìn)展，這表明Sema可以成為一個(gè)潛在的抗腫瘤血管生成的因子[26]。

3.1.2NRPs與Sema3B。脊椎動(dòng)物的腫瘤模型中，Sema3B的表達(dá)可以抑制肺癌、卵巢癌細(xì)胞的生成、增殖以及降低細(xì)胞致瘤性；與此相似的是，在癌細(xì)胞中Sema3B可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且阻斷VEGF與NRPs結(jié)合[27]。此外，NRP-1-Sema3B的交互作用可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中IL-8的高水平，這將導(dǎo)致單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的大量生成，從而促進(jìn)了癌腫的侵襲及轉(zhuǎn)移[28]。

3.1.3NRPs與Sema3F。Rolny等人[29]在肺癌中觀察到Sema3F可能和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性及侵襲性相關(guān)。隨后，多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Sema3F可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。將轉(zhuǎn)染有Sema3F的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞移植至小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，參與腫瘤血管生成的VEGF165得到抑制，但空白組即無(wú)轉(zhuǎn)染Sema3F的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的小鼠體內(nèi)VEFG165并沒(méi)有改變；轉(zhuǎn)染有Sema3F的腎癌細(xì)胞中，癌細(xì)胞體積縮小且腫瘤血管發(fā)育不良[30]。因此，可以認(rèn)為Sema3F與VEGF在細(xì)胞增殖過(guò)程中有相反的作用。Sema3F抗黑色素瘤細(xì)胞生成的作用與NRPs受體相關(guān)[31]。 此外，Sema3F降低了乳腺癌細(xì)胞的粘附能力及侵襲能力，這也與NRP-1或NRP-2相關(guān)[32]。

3.2NRPs與生長(zhǎng)因子的聯(lián)系

3.2.1NRPs與VEGFRs。與神經(jīng)纖毛蛋白分子相關(guān)的VEFG家族受體的深入研究表明，NRPs通過(guò)與VEGFR1和VEGFR2的結(jié)合促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤血管生成。Takagawa[9]報(bào)道了NRP1與VEGFR1和VEGFR2均可結(jié)合， NRP-1 和NRP-2可以提高VEGF與VEGFR1及VEGFR2結(jié)合的能力。很多實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明NRP-1在血管生成以及NRP-2在淋巴管形成及腫瘤侵襲方面的作用。NRP-2純合子突變體的小鼠具有淋巴管及微血管異常增生的特性[8]。

3.2.2NRPs與整聯(lián)蛋白。整聯(lián)蛋白(integrin，ITG)在細(xì)胞的粘附、生存、遷移、侵襲以及血管生成中起到重要作用，這些都被認(rèn)為是有很強(qiáng)的致癌作用。多種整聯(lián)蛋白和癌癥的發(fā)展有關(guān)。Fukasawa等人[33]發(fā)現(xiàn)在胰管癌中，NRP-2通過(guò)與ITG -β1相互作用來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存和侵襲。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ITG -β3通過(guò)減少NRP-2與VEGFR2結(jié)合，從而抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成[34]。

3.2.3NRPs與c-met。近年來(lái)，肝素生長(zhǎng)因子如FGF和HGF可以作為NRPs的配體,從而促進(jìn)NRPs介導(dǎo)的血管生成。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌中，NRP-1可以加強(qiáng)HGF和FGF2誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲能力；NRPs可以作為HGF的受體，也可以通過(guò)激活c-met受體本身來(lái)增強(qiáng)它的磷酸化作用；免疫共沉淀研究證明NRPs可以與c-met受體直接作用[35]。

3.2.4NRPs與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體(TGFRs)。研究證明NRP-1是活化型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體TGFβ1與潛在型TGFβ1的受體。Glinka等人[36]發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，NRP-1可以與TGFRI和TGFRII結(jié)合，從而促進(jìn)TGFβ1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用。NRP-1通過(guò)PDGF/TGFβ1通路使得人肝細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞有了肌成纖維細(xì)胞的表型[37,38]。NRP-2也可以使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞的表型，表明NRP-2也參與了上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)[38]。EMT的主要特征是細(xì)胞連接斷裂，上皮細(xì)胞的特征、細(xì)胞極性減少，從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展。EMT除了是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志,還可以促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲以及增強(qiáng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力[39]。

4NRPs：腫瘤進(jìn)展的替代性標(biāo)志物

由于NRP-1和 NRP-2與多種生理過(guò)程如血管再生、淋巴管的生成、EMT和細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)，NRP-1、NRP-2的檢測(cè)有望成為多種腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志。

在骨肉瘤[17]和非小細(xì)胞肺癌[18]中，NRP-2的表達(dá)與多血管的生成及預(yù)后不相關(guān)。在唾液囊腺癌中也可以檢測(cè)到NRP-2的表達(dá)，而它的表達(dá)水平與微血管密度、腫瘤大小、臨床分期、血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[40]。在乳腺癌中，NRP-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGF-C的表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的趨化因子受體4 (chemokine receptor4，CXCR4)的表達(dá)相關(guān)[19]。在早期及中晚期成神經(jīng)細(xì)胞瘤中NRP-2的表達(dá)水平上調(diào)[17]。此外，NRP-2在多種分泌型胰腺腫瘤中表達(dá)增高，提示NRP-2可以作為一種診斷這些腫瘤疾病的標(biāo)記物[18]。NRP-2也對(duì)膀胱癌的發(fā)展有為潛在的生物標(biāo)記物的作用[41]。

5NRPs與腫瘤靶向治療

5.1RNA干擾技術(shù)在多種人體癌癥體外模型中，小干擾RNA作用于NRP-1可以有效地減少腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、血管生成及細(xì)胞轉(zhuǎn)移[42]。在小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)短發(fā)卡RNA使得結(jié)腸癌中NRP-2表達(dá)水平降低，誘導(dǎo)生成的癌細(xì)胞的形狀更小，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移減少，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)[43]。除此之外，在患有腫瘤的小鼠體內(nèi)，通過(guò)腹腔灌注脂質(zhì)體來(lái)控制NRP-2的小干擾RNA將減少腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[43]。

5.2小分子治療技術(shù)基因的選擇性剪切增加了可溶性NRP-1及可溶性NRP-2的產(chǎn)生。這些可溶性NRPs作為一種抑制分子被認(rèn)識(shí)，功能上等同于天然配體，抑制了同膜受體的相互作用?？扇苄訬RPs缺乏跨膜域和胞內(nèi)域。Schuch等人[41]通過(guò)使用NMuMG/VEGF與NMuMG/sNRP-1細(xì)胞系移植至患有肉瘤的小鼠體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?發(fā)現(xiàn)VEGF與sNRP-1重組體的水平增高。單獨(dú)使用VEGF處理腫瘤細(xì)胞會(huì)促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)和血管生成，但當(dāng)治療中加入sNRP-1時(shí)卻會(huì)抑制腫瘤增長(zhǎng)和血管生成。此外，在全身性白血病模型中，相較于對(duì)照組，注射編碼有sNRP-1二聚體的腺病毒后，小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng)[41]。

Geretti等人[44]發(fā)現(xiàn)一種B區(qū)域發(fā)生突變的NRP-2的的突變體(mutant of the B-domain of NRP-2，MutB-NRP-2)，它在NRP-2的B區(qū)域多了含有8個(gè)折疊肽的部分，相比于野生型B區(qū)域的NRP-2，MutB-NRP-2與VEGF的結(jié)合能力更強(qiáng)。在小鼠體外模型實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)應(yīng)用MutB-NRP-2或聯(lián)合貝伐單抗治療黑色素瘤可以有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)[44]。

通過(guò)對(duì)隨機(jī)表達(dá)縮氨酸的噬菌體庫(kù)的篩選發(fā)現(xiàn)，這些縮氨酸可以與多種腫癌細(xì)胞結(jié)合，有效地鑒別捆綁NRPs的氨基酸序列。Sugahara等人[45]報(bào)道了滲透于2種組織的縮氨酸與人integrins和NRP-1結(jié)合后可以滲透到腫瘤細(xì)胞及組織中。這些縮氨酸與抗腫瘤藥物或顯影劑結(jié)合后可以使腫瘤更易成像或者增加抗腫瘤藥物的有效性[45]。

5.3單克隆抗體Liang[46]發(fā)現(xiàn)了以NRP-1作為靶點(diǎn)的單克隆抗體。尤其是可以生產(chǎn)作用位點(diǎn)在CUB區(qū)域(anti-NRP-1A)和在凝血因子III/IV(anti-NRP-1B)的抗NRP-1的高親和力單克隆抗體。隨后發(fā)現(xiàn)，抗NRP-1的單克隆抗體可以阻斷VEGF與NRP-1的結(jié)合，其與抗VEGF單克隆抗體抗腫瘤有累積作用，從而減少腫瘤的生長(zhǎng)[47]。

5.4神經(jīng)叢素NRPs在腫瘤發(fā)生中的作用比最初認(rèn)為的自然配體更為復(fù)雜。在腫瘤環(huán)境中，表觀上是VEGF和Semaphorins及NRPs的結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，只是結(jié)合位點(diǎn)的不同。然而，Semaphorins可以抑制腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移，VEGF更傾向于促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管形成。綜上所述，認(rèn)為一些Sema如Sema3B和Sema3F是腫瘤抑制基因(TSG)在腫瘤細(xì)胞中的負(fù)向調(diào)節(jié)作用[26]。Sema基因的過(guò)表達(dá)有望成為新型的防止腫瘤血管生成、腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的治療方式。此外，Sema的其他成員如Sema3E和Sema4D有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及血管形成的作用[46~48]，這些分子及其相應(yīng)受體的中和狀態(tài)為腫瘤治療提供了新的理論依據(jù)。尤其是一種單克隆抗體VX15/2503，它與Sema4D結(jié)合已進(jìn)入中晚期實(shí)體瘤治療的第一階段臨床試驗(yàn)，Sema途徑的治療應(yīng)用可能代表在對(duì)抗VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管形成及腫瘤進(jìn)展治療的新戰(zhàn)略[49]。

6展望

在生理及病理過(guò)程中，NRPs是3型Sema及VEGF家族的多功能非酪氨酸激酶受體。NRPs在內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。盡管它們直接與Plex和生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，但是研究很快認(rèn)識(shí)到它們是脈管生成、ENT、腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。在多種惡性腫瘤中，NRPs家族之一表達(dá)或者兩者共表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后不良相關(guān)。 因此,許多一直NRPs功能的早期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)展，如通過(guò)siRNAtive基因敲除、小縮氨酸抑制素以及封閉性抗體。然而，NRPs調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展的分子機(jī)制尚不完全明確，了解VEGF、VEGFRs、Sema和NRPs之間的關(guān)系，有望為抗腫瘤治療提供新的戰(zhàn)略及促進(jìn)其理性地發(fā)展。

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(2015-06-05收稿)(王一伊編輯)