人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前研究進(jìn)展＊

張遞思綜述，史明霞△，董 堅(jiān)審校

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.血液科；2.腫瘤內(nèi)科，昆明650032）

羊膜位于胎盤(pán)的最內(nèi)層，主要由來(lái)源于外胚層的上皮細(xì)胞和來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。其不含血管，細(xì)胞成分相對(duì)簡(jiǎn)單，在胎兒娩出后即成為“廢棄物”。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）有著來(lái)源豐富、無(wú)需有創(chuàng)操作、取材幾乎不受限制、分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便、有向3個(gè)胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化的潛能、免疫原性低等多種優(yōu)點(diǎn)，可能成為一種更加理想的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）臨床研究及應(yīng)用的來(lái)源［1］。

1 hAMSCs的生物學(xué)特性

1.1 免疫表型及基因表達(dá) 目前，hAMSCs還沒(méi)有統(tǒng)一的表面標(biāo)志物，但是大多數(shù)表面抗原和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）相似。Kim 等［2］通過(guò)分離羊膜間充質(zhì)細(xì)胞并在體外擴(kuò)增至第2、3代后獲得成纖維樣細(xì)胞，通過(guò)不同的培養(yǎng)條件分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞。免疫表型分析結(jié)果顯示，其表達(dá)SSEA-3、SSEA-4、膠原 蛋白-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ、-Ⅳ、-Ⅻ、纖維連接蛋白、α-SMA、波形蛋白（Vimenti）、結(jié)蛋白、細(xì)胞角蛋18（CK18）、HCAM-1、成纖維細(xì)胞表面蛋白和人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）-ABC；弱表達(dá)ICAM-1 蛋白；不表達(dá)TRA-1-60、VCAM-1、vWF、PECAM-1和HLA-DR。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)論傳至幾代，一些基因［如：Oct-4、Rex-1、SCF、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（nerve cellular adhesion mo1ecul，NCAM）、巢蛋白（Nestin）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogeneticprotein，BMP）4、心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、肝細(xì)胞核因子（hepatocyte neclear factor，HNF）-4α、波形蛋白（Vimenti）、CK18］始終持續(xù)表達(dá)。而一些基因（如：鼠短尾突變體表型、FGF-5、Pax-6和BMP2）不表達(dá)。其中，研究發(fā)現(xiàn)，α-甲胎蛋白、HLA-ABC、HLA-DR基因表達(dá)于早期（2～3代）的細(xì)胞中而不表達(dá)于晚期（7～13代）的細(xì)胞中，且在第3代以上的細(xì)胞中可檢測(cè)出端粒酶活性。近年來(lái)，流式細(xì)胞儀分選干細(xì)胞側(cè)群技術(shù)廣泛應(yīng)用于提取多分化潛能干細(xì)胞。樸正福等［3］利用流式細(xì)胞分選技術(shù)hAMSCs中分離提純干細(xì)胞（hAMC-SP細(xì)胞），通過(guò)FACS分析結(jié)果示，此細(xì)胞表達(dá)Nestin、Vimentin、整合素家族成員（CD49b、CD49c、CD49d、CD49e）、CD9、CDl3、CDl9、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CDl66及干細(xì)胞相關(guān)的Oct-3／4 抗原。HLA-ABC、TRA-1-81 及SSEA-4為弱表達(dá)；CD34、CD45、CDll7、CD56、CD90、CDl05、CDl06、CDl33、Fit1、Musashil及HLA-DR無(wú)陽(yáng)性結(jié)果，TRA-1-60及SSEA-3也表達(dá)陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此細(xì)胞與其他間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記，表達(dá)整合素分子成員及間充質(zhì)干細(xì)胞特征性表面標(biāo)志蛋白。

1.2 增殖能力、免疫原性及致瘤性 SSEA-3、SSEA-4是胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞的表面標(biāo)志特征，成體干細(xì)胞包括BMMSCs無(wú)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SSEA-3、SSEA-4，說(shuō)明AM-MSCs可能是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的一個(gè)中間等級(jí)的干細(xì)胞，因此，其增殖能力比BMMSCs更強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)傳至（14.5±0.9）代、培養(yǎng)（146.8±8.9）d后、群體培增平均數(shù)（36.9±4.7）后細(xì)胞衰老［2］。

人羊膜細(xì)胞的低免疫原性和人羊膜組織移植不易引起免疫排斥反應(yīng)。有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將AM-MSCs與人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）或純化的T 細(xì)胞直接transwell共培養(yǎng)都可以抑制同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，隨著AM-MSCs細(xì)胞的增多，其抑制效應(yīng)越明顯，當(dāng)細(xì)胞比例達(dá)到l∶l時(shí)，抑制效應(yīng)最強(qiáng)。近來(lái)有學(xué)者進(jìn)一步研究表明hAMSCs通過(guò)分泌可溶性因子在抑制淋巴細(xì)胞增殖中起作用，其中前列腺素可能是關(guān)鍵的效應(yīng)分子。并且首次證實(shí)了hAMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力是其本身所具有的，而不是像BMMSCs抑制淋巴細(xì)胞增殖需要活化刺激等條件［4-5］。近來(lái)研究報(bào)道，采用原代或第1～3代的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療，不會(huì)有致瘤的危險(xiǎn)。而目前對(duì)于hAMSCs的致瘤性問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外的研究均較少。樸正福等［3］通過(guò)在體外進(jìn)行癌化實(shí)驗(yàn)，提示hAMSCs傳代培養(yǎng)時(shí)保持細(xì)胞原有的特性，不具有致瘤性。利用體外細(xì)胞集落分析方法對(duì)hAMSCs的致瘤性進(jìn)行了簡(jiǎn)單的研究，發(fā)現(xiàn)AMC-SP 細(xì)胞未形成集落，而作為陽(yáng)性對(duì)照的HepG2形成了多數(shù)較大集落。

2 hAMSCs的臨床前研究

干細(xì)胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的細(xì)胞群體，是替代、修復(fù)或加強(qiáng)受損或衰老組織、器官功能的理想種子細(xì)胞，是組織工程再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要生物材料來(lái)源。hAMSCs能分化為多種細(xì)胞，且因其自身的諸多優(yōu)勢(shì)，使其在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)已有不少學(xué)者對(duì)其做了許多臨床前的探索研究。

有研究證實(shí)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)人臍血單個(gè)核細(xì)胞和CD34＋細(xì)胞擴(kuò)增，擴(kuò)增后兩者在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中能夠形成造血祖細(xì)胞集落，其造血支持作用與BM-MSCs相似，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［6］。最近有學(xué)者首次使用hAMSCs移植治療大劑量順鉑誘導(dǎo)的骨髓抑制，發(fā)現(xiàn)hAMSCs移植治療較早地改善順鉑所致骨髓抑制小鼠的造血功能［7］。

Kim 等［8］發(fā)現(xiàn)hAMSCs較脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)更高水平的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A、血管生成素-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF-2），特別是抗凋亡因子（Akt-1）也在hAMSCs中高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)移植hAMSCs入小鼠缺血性后肢中，觀(guān)察到其自發(fā)的形成血管樣結(jié)構(gòu)以及表達(dá)特定的內(nèi)皮基因和蛋白。移植hAMSCs后增強(qiáng)血液灌注及毛細(xì)血管密度，表明hAMSCs能增加新血管形成，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)其移植率高。以上說(shuō)明移植hAMSCs在治療缺血性下肢中可能具有可觀(guān)的療效。Warrier 等［9］采用實(shí)時(shí)熒光PCR（RT-PCR）、免疫組織化學(xué)法等方法顯示羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外有生成內(nèi)皮和血管的能力。進(jìn)一步研究證實(shí)其本身表達(dá)促血管生成因子（如：Tie2、Ang1、VEGF、VEGFR、vWF、KDR 和Flt4）。這表明可將其應(yīng)用于創(chuàng)傷愈合、中風(fēng)、缺血性疾病和組織修復(fù)中。Kim 等［10］和Fatimah等［11］采用糖尿病的NOD／SCID 小鼠模型，也證實(shí)了羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)分泌血管新生因子和增強(qiáng)移植分化能力，促進(jìn)傷口愈合。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)連續(xù)傳代培養(yǎng)后羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管生成素-1的表達(dá)增強(qiáng)。因胎兒的創(chuàng)傷愈合需要最小的炎性反應(yīng)和有限的疤痕，Klein等采用胎羊羔模型發(fā)現(xiàn)，雖hAMSCs不是創(chuàng)傷愈合過(guò)程中絕對(duì)必需的，但其能加快創(chuàng)傷閉合，增加傷口處的細(xì)胞外基質(zhì)。而對(duì)其中轉(zhuǎn)化的影響還需進(jìn)一步研究。

近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs在體外經(jīng)自然生物誘導(dǎo)劑RPE（老鼠再生胰腺提取物）誘導(dǎo)可分化為分泌胰島素的細(xì)胞［12］。也有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)（ILC），采用免疫組織化學(xué)法顯示已分化的ILC 可表達(dá)人胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素。而實(shí)時(shí)定量PCR 顯示除表達(dá)人胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素，還表達(dá)Ngn3、Isl1。將其移植入實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠，可使小鼠恢復(fù)正常的血糖且沒(méi)有免疫排斥［13］。以上說(shuō)明羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有形成新生胰島的能力，使其可能用于細(xì)胞替代治療糖尿病。

hAMSCs也能分化為神經(jīng)元細(xì)胞。有研究證實(shí)將經(jīng)BHA誘導(dǎo)的hAMSCs移植入小鼠局灶缺血模型（此模型有不同程度的左側(cè)偏癱伴隨右側(cè)霍納氏綜合征），分別于1、3、6、8周后檢查，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，移植組小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有明顯的改善。且移植入小鼠體內(nèi)的hAMSCs主要集中于移植部位及其周邊區(qū)域，而在某些特定的情況下，其向缺血部位遷移。未檢測(cè)到缺血部位的膠質(zhì)增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，用BHA 誘導(dǎo)過(guò)的hAMSCs能分化為表達(dá)NSE 的神經(jīng)元樣細(xì)胞。此外，hAMSCs移植可能改善局灶性腦缺血后造成的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［14-15］。近來(lái)以大鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs能顯著改善腦缺血大鼠的行為障礙、減少腦梗死體積及提高功能恢復(fù)。將hAMSCs移植入阿爾茨海默病老鼠中，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)免疫調(diào)節(jié)及旁分泌機(jī)制持久地改善了老鼠的記憶功能［16］。Paracchini等研究發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞有可能分化為與囊胞性纖維癥（CF）發(fā)病相關(guān)的器官（肝與肺）的上皮細(xì)胞，并能有助于部分修復(fù)CF的表型。有研究表明，hAMSCs能分化為心肌細(xì)胞，且能高效率地重組成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（MiPSCs），由MiPSCs分化得來(lái)的心肌細(xì)胞表達(dá)c-kit細(xì)胞的表面標(biāo)志，其能純化心肌細(xì)胞群且能用于同種異體的心臟干細(xì)胞療法［17-18］。最近研究發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)系統(tǒng)能增加hAMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，使其能更有效地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)［19］。還有學(xué)者通過(guò)將羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞直接移植入心肌梗死的NOD／SCID小鼠模型中的缺血心肌組織的周邊，發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能顯著表達(dá)相關(guān)的趨化因子及其受體，并改善了心臟功能，這一試驗(yàn)表明了將羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于缺血性心血管病的治療的可能性［20］。

有學(xué)者建立有氣管缺陷的胎兒羊羔模型，發(fā)現(xiàn)移植羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能增加其氣管的修復(fù)，表明了將來(lái)應(yīng)用于圍產(chǎn)期兒氣道修復(fù)的可能性［21］。在博來(lái)霉素誘發(fā)的肺損傷活體模型中研究中發(fā)現(xiàn)，hAMSC能減輕肺纖維化、炎性反應(yīng)，以及恢復(fù)肺的通氣功能。

近來(lái)有學(xué)者用載有hAMSCs的羊膜直接移植到有皮膚傷口的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)促進(jìn)表皮干細(xì)胞和毛細(xì)血管的再生促進(jìn)皮膚愈合［22］。也有學(xué)者用hAMSCs與hAECs細(xì)胞構(gòu)建雙層膜結(jié)構(gòu)的皮膚組織，發(fā)現(xiàn)其與人皮膚組織有相似的形態(tài)，擁有表皮和真皮，且能成功修復(fù)無(wú)胸腺小鼠的全層皮膚缺損［22］。

在移植hAMSCs入四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型中實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其能減少肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝的纖維化［23］。這為臨床提供了一種治療肝纖維化疾病的新方法。

Lange-Consiglio等［24］首次比較了羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞與BM-MSCs在治療馬的肌腱、韌帶損傷的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的療效優(yōu)于BM-MSCs。還有學(xué)者研究證實(shí)BM-MSCs的一些治療應(yīng)用可被羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞等其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞所取代，包括移植物抗宿主病的治療［25］。

Han等［26］通過(guò)流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)于女性生殖系統(tǒng)及妊娠子宮中的HOXA9、HOXA10、HOXA11基因也表達(dá)于羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞上，并通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)推斷其可能作為子宮干細(xì)胞療法的新來(lái)源。

Sakuragawa等發(fā)現(xiàn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞的表型。最近又有研究證實(shí)hAMSCs有可能應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療。

3 展 望

hAMSCs具有取材方便、來(lái)源廣泛、不易受污染、幾乎不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議、分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、免疫原性低、細(xì)胞增殖能力強(qiáng)、強(qiáng)分化潛能等眾多優(yōu)越性，使其在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有良好的應(yīng)用前景。但目前仍有許多需要解決的問(wèn)題：（1）hAMSCs的分離純化技術(shù)還有待提高；（2）hAMSCs的準(zhǔn)確鑒定方法還有待研究；（3）hAMSCs在體內(nèi)存活、遷移、分化的機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索研究；（4）hAMSCs在體內(nèi)成瘤性方面的研究還很少。相信隨著對(duì)hAMSCs更加深入的研究，未來(lái)必定能充分發(fā)揮hAMSCs的優(yōu)勢(shì)，將其廣泛應(yīng)用于臨床上的治療。

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