氮6-環(huán)戊基腺苷對大鼠腎缺血再灌注腎細胞凋亡的影響

馬漫漫，王 超，董振明

(1. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

氮6-環(huán)戊基腺苷對大鼠腎缺血再灌注腎細胞凋亡的影響

馬漫漫1，王 超1，董振明2

(1. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

目的 觀察氮6-環(huán)戊基腺苷(CPA)對大鼠缺血再灌注(I/R)腎細胞凋亡的影響。方法 健康SD大鼠32只隨機分成4組，每組8只。假手術組(S)組只進行手術操作，不做其他處理；I/R組腎缺血45 min再灌注24 h；C組給予CPA 1.0 mg/kg夾閉腎動脈前15 min腹腔注射，余操作同I/R組；CD組給予CPA 1.0 mg/kg和8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤(DPCPX)1.0 mg/kg在夾閉腎蒂前15 min腹腔注射，余操作同I/R組。所有動物于再灌注24 h處死。腎組織制備腎臟單細胞懸液，經碘化丙啶染色后用流式細胞分析法測定腎臟細胞凋亡率。結果 I/R組、C組和CD組腎組織細胞凋亡率明顯高于S組(P均<0.05)，C組腎組織細胞凋亡率明顯低于I/R組及CD組(P均<0.05)；I/R組與CD組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 CPA可抑制細胞凋亡，對大鼠腎I/R損傷有一定的保護作用。

腎；再灌注損傷；氮6-環(huán)戊基腺苷；8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤；細胞凋亡

外科手術中高難度的腎臟手術如腎臟移植術、腎臟切開取石術、腎腫瘤術、腎部分切除術、血管外科的主動脈修補術需要阻斷腎臟血流，血流開放時易引起缺血再灌注(I/R)損傷。氮6-環(huán)戊基腺苷(CPA)是腺苷A1受體激動劑，其對腦、心臟I/R有一定的保護作用。本實驗通過建立大鼠腎I/R損傷模型，探討CPA對大鼠腎I/R損傷的保護作用，旨在為尋找治療腎I/R損傷的有效藥物提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1主要設備及試劑 流式細胞儀(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心)，小動物呼吸機，小動物實驗操作臺，CPA購自Sigma公司，美國，8-環(huán)戊基-1，3-二丙基嘌呤(CDPCPX,Sigma公司，美國)，水合氯醛。

1.2實驗動物及分組 健康SD雄性大鼠32只，河北醫(yī)科大學實驗中心提供，體質量250～300 g，動物合格證號：1182430。隨機分成假手術組(S組)、I/R組、CPA預先給藥+I/R組(C組)、CPA+CDPCPX預先給藥+I/R組(CD組)，每組8只。

1.3實驗方法 大鼠術前12 h禁食，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛0.3 g/kg麻醉后，做右頸內靜脈穿刺置管用微量泵持續(xù)輸液用。75%乙醇消毒腹部皮膚，暴露手術區(qū)域，用無菌生理鹽水浸濕的紗布作為無菌單鋪墊術野，沿腹正中線剪開腹部皮膚，鈍性分離肌肉，打開腹腔，分離腎包膜，暴露腎臟，輕柔操作，仔細尋找、分離腎蒂，保護輸尿管，用無損傷動脈夾同時夾閉兩側腎蒂，開始計時。肉眼觀察腎臟的顏色由暗紅色變?yōu)樽霞t色即可確認腎血流被阻斷，造成腎臟缺血。間斷夾閉腹部切口，用鹽水紗布覆蓋。缺血45 min后，再次打開腹腔，暴露腎臟，顯露腎蒂，松開動脈夾，腎由紫紅色恢復為暗紅色可確認血流恢復，再灌注成功，同時開始記錄再灌注時間。逐層縫合腹部正中切口，75%乙醇消毒手術切口。繼續(xù)觀察2 h，如果大鼠能夠正常活動說明造模成功。術后大鼠置于鼠籠，保持24～29 ℃的環(huán)境，密切觀察大鼠生命體征，給予正常飲食，再灌注24 h即為I/R模型。剔除松開動脈夾5 min后腎臟未變?yōu)檎＜t色的大鼠，術中損傷大血管或者周圍組織導致造模不成功大鼠，術后觀察2 h不能正常活動大鼠。

1.4觀察指標 實驗結束，處死大鼠，腎組織制備腎臟單細胞懸液，經碘化丙啶(propidine iodide,PI)染色后用流式細胞分析法測定腎臟組織細胞凋亡率。

2 結 果

再灌注24 h時，S組、I/R組、C組和CD組腎組織細胞凋亡率分別為(2.67±0.85)%，(15.12±1.65)%，(9.23±1.98)%和(14.17±1.42)%。腎組織細胞凋亡率I/R組、C組和CD組明顯高于S組(P均<0.05)，C組明顯低于I/R組和CD組(P均<0.05)，而I/R組與CD組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組流式細胞分析法測得腎組織細胞凋亡情況見圖1～4。

圖1 再灌注24 h時S組腎組織細胞凋亡情況

3 討 論

腎I/R損傷是指腎缺血后,當自主循環(huán)功能恢復、組織再灌注后，缺血性損傷仍繼續(xù)發(fā)展，進一步發(fā)生組織水腫及持續(xù)低灌流狀態(tài)，結果使細胞繼續(xù)缺血缺氧導致細胞變性和壞死，甚至發(fā)生更為嚴重的組織損傷或腎衰竭。腎臟為高灌注器官，對缺血及再灌注均敏感。目前一致認為缺血20～40min

圖2 再灌注24 h時I/R組腎組織細胞凋亡情況

圖3 再灌注24 h時C組腎組織細胞凋亡情況

圖4 再灌注24 h時CD組腎組織細胞凋亡情況

再灌注，其損傷是可逆轉的；缺血40～60 min后再灌注，損傷則不可逆轉。故本研究采用夾閉雙側腎蒂45 min再灌注24 h制備腎臟I/R損傷模型。

當腎組織發(fā)生急性缺血時,組織細胞的氧化磷酸化過程停止，能量迅速消耗，進一步使腎功能活動發(fā)生障礙，Na+、K+、Ca2+等離子跨膜轉運受到影響，使細胞內Na+、Ca2+增多，細胞腫脹，功能逐漸喪失。另外腎缺血后ATP降解生成大量次黃嘌呤，再灌注恢復后，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化作用下生成黃嘌呤，從而產生大量氧自由基和羥自由基。產生的自由基可通過膜的脂質過氧化作用對腎組織造成損害，降解生物膜中的多不飽和脂肪酸，損傷細胞膜和線粒體膜的結構和功能，造成各種細胞功能障礙，這些氧自由基及羥自由基對腎近曲小管損傷最重[1]。

本研究結果顯示，C組腎細胞凋亡率明顯低于I/R組和CD組，表明CPA可以增加組織的抗氧化能力，降低再灌注腎組織的細胞凋亡率。Saikumar等[2]在腎損傷模型中發(fā)現(xiàn),缺血能夠導致以細胞凋亡為主的細胞死亡,再灌注時由于線粒體膜通透性增加,啟動了Caspase家族蛋白酶,引起序列DNA酶效應，從而進一步加重細胞凋亡[3]。

近來研究證明在心肌缺血前,應用腺苷可縮小心肌壞死面積,促進再灌注時心臟功能恢復,減少心肌細胞損傷,這種作用可被選擇A1受體拮抗劑所阻斷[4]。在心肌缺血時,應用腺苷可促進其功能的恢復和減少心肌細胞損傷,減少ATP分解。Zhao等[5]在犬I/R模型中應用腺苷140 mg/(kg·min)治療,結果顯示 ,腺苷在再灌注時通過調節(jié)抑制凋亡蛋白Bcl-2,促進凋亡蛋白Bax的表達,同時通過減少中性粒細胞聚集,從而抑制了心肌細胞凋亡。Leesar等[6]將30例擇期經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA) 患者(不穩(wěn)定型心絞痛13例,穩(wěn)定型心絞痛17例,均是左前降支或回旋支的近端狹窄，狹窄>70%)隨機分為腺苷組和鹽水對照組,腺苷以2 mg/min的速度冠脈內注射10 min，然后行PTCA,共行3次球囊擴張,每次擴張持續(xù)2 min,球囊擴張之間間隔5 min,結果表明在冠脈左前降支行PTCA術時,腺苷對抗缺血造成的心肌損害十分有效,有效性甚至強于缺血預適應。Heidland等[7]報道,在為患者行PTCA前冠脈內注入腺苷20 mg,可以增強心肌對缺血的耐受(具體表現(xiàn)為耐受更長時間的球囊擴張、心電圖上缺血征象減輕及胸痛減輕)，并能預防缺血期間左室功能的減退。Wei等[8]將30例需行搭橋的患者分為腺苷組和對照組,每組各15例。其中腺苷組于冠脈搭橋(CABG)術前經靜脈輸入腺苷(開始劑量50 μg/kg,在第2分鐘加量至100 μg/(kg·min),持續(xù)7 min,總量650 μg/kg),輸注腺苷結束后3 min開始行體外循環(huán)。結果術后腺苷組CK生成較少,心臟指數(shù)明顯改善,提示在CABG前應用腺苷對心臟有保護作用。王陽等[9]研究表明腺苷能夠抑制氧自由基的生成，減輕脂質過氧化，對心肌I/R損傷有保護作用。

目前研究認為iNOS是腺苷受體激動劑預處理產生保護作用的效應酶[10]，以腺苷A1受體激動劑2-氯-N6-環(huán)戊基腺苷(CCPA)預處理能觸發(fā)胞內信號傳遞系統(tǒng)產生與缺血預處理相同的保護效應。Baxter等[11]根據(jù)CCPA用量分為25，50，100 μg/kg 3組,自兔耳緣靜脈注射,結果對血壓及心率影響均較小(P均<0.05)，24 h后心肌保護程度隨CCPA用量的增加而增強。李小鷹等[12]和戴成等[13]R-苯異丙基腺苷(PIA)預處理大鼠，結果同樣產生心肌保護效應,如縮小心肌梗死面積和降低缺血性心律失常的發(fā)生率。提示腺苷A1受體是保護作用的腺苷受體亞型。本研究結果表明CPA能夠減輕腎組織細胞凋亡，DPCPX可以阻斷CPA的保護作用，CPA保護作用可能是通過激動腺苷A1受體來實現(xiàn)的。CPA預先給藥可抑制腎組織細胞凋亡，防治腎臟I/R損傷，對大鼠腎I/R損傷有保護作用。

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[13] 戴成,李小鷹,荊忱. 腺苷A1受體激動劑R-苯異丙基腺苷介導的大鼠心肌延遲預適應[J]. 中華老年心腦血管病雜志,2001，3(3):187

Effect of N6-cyclopentyl adenosine on the apoptosis of renal cells in rats after kidney ischemia-reperfusion

MA Manman1, WANG Chao1, DONG Zhenming2

(1. The Central Hospital of Handan, Handan 056000, Hebei, China; 2. The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China)

Objective It is to observe the effect of N6-cyclopentyl adenosine (CPA) on the apoptosis of renal cells in rats after kidney ischemia-reperfusion(I/R). Methods 32 healthy SD rats were randomly divided into 4 groups, each group had 8 rats. Sham group (S group) was operated only without other treatment, I/R group undergone kidney ischemia for 45 min and reperfusion for 24 h, C group was given CPA 1.0 mg/kg by intraperitoneal injection 15 min before renal artery blocking, and the rest operation was the same as I/R group, CD group was given CPA 1.0 mg/kg and 8-cyclopentyl-1, 3-2-propylxanthine (DPCPX) 1.0 mg/kg by intraperitoneal injection 15 min before renal artery blocking, and the rest operation was the same as I/R group. All the animals was killed in 24 h after reperfusion. Renal tissue was taken to made renal single cell suspension, and the apoptosis rate of renal cells was detected by flow cytometer after staining by propidium iodide. Results The apoptosis rates of renal cells in I/R group, C group and CD group were significantly higher than that in S group (Pall<0.05), and the rate in C group was obviously lower than that in I/R group and CD group (P<0.05). There was no significant difference in the rate between I/R group and CD group (P>0.05). Conclusion CPA can inhibit cell apoptosis, and has some protecting effect on renal I/R injury in the rats.

kidney; reperfusion injury;8-cyclopentyl-1, 3-2-propylxanthine; 8-cyclopentyl-1, 3-2-propylxanthine; cell apoptosis

馬漫漫，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事臨床麻醉工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.005

R-332

A

1008-8849(2015)04-0356-03

2014-08-20