三七總皂苷調(diào)節(jié)哮喘小鼠氣道炎癥的免疫分子機制研究

趙文娟，陳 靜，邢海晶，袁嘉麗，韓妮萍

(云南中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

三七總皂苷調(diào)節(jié)哮喘小鼠氣道炎癥的免疫分子機制研究

趙文娟，陳 靜，邢海晶，袁嘉麗，韓妮萍

(云南中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

目的 觀察三七總皂苷(PNS)對哮喘小鼠氣道炎癥的療效及對免疫細胞Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用，從免疫平衡的角度尋找其作用靶點，探討PNS防治支氣管哮喘的可能作用機制。方法 將SPF級BALB/c雌性小鼠50只隨機分成正常對照組、哮喘模型組及PNS低、中、高劑量組。以卵清白蛋白(OVA)腹腔注射及霧化激發(fā)法構(gòu)建哮喘模型。觀察小鼠肺組織病理變化，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組小鼠血清中IL-4、IFN-γ的變化。結(jié)果 PNS低、中、高劑量組哮喘癥狀有所減輕，肺組織炎性細胞浸潤減輕，且小鼠血清中IFN-γ的表達具有升高趨勢，以低、中劑量組效果明顯(P<0.05和P<0.01)，PNS中劑量組和PNS高劑量組血清IL-4濃度明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 PNS可減輕哮喘小鼠肺組織炎性細胞浸潤，減少氣道上皮黏液分泌，改善氣道炎癥狀態(tài)。PNS防治哮喘的機制之一可能是通過上調(diào)哮喘小鼠IFN-γ的分泌，抑制IL-4的分泌，進而促進Th0向Th1分化，抑制Th0向Th2分化，恢復Th1/ Th2平衡狀態(tài)。

三七總皂苷；哮喘小鼠；白細胞介素-4；干擾素-γ

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞包括氣道的炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分(cellular elements)參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。目前全球哮喘患者約3億人，中國哮喘患者約3 000萬，隨著空氣污染等環(huán)境問題的日益嚴重以及飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的變化，哮喘發(fā)病率仍在逐年增高。支氣管哮喘的病因和發(fā)病機制并未完全闡明，但已證實炎癥-免疫反應是哮喘發(fā)生的關(guān)鍵機制之一，氣道炎癥反應、氣道高反應性和氣道重塑3個基本病變貫穿哮喘整個病變過程。免疫細胞CD4+Th亞群形成的Th1/Th2平衡的失調(diào)是哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因之一，促進Th分化的細胞因子以及Th亞群效應因子在肺組織局部和全身水平的變化，是導致失衡機制的基本因素[2]。具體而言，Th1/Th2 分泌的細胞因子發(fā)生失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機制，即促進Th1分化的細胞因子IL-12、IFN-γ減少，而抑制Th1分化促進Th2分化的細胞因子IL-4和IL-10的分泌增加[3]。支氣管哮喘屬中醫(yī)學“哮證”范疇,近年來認為“瘀血”在哮喘發(fā)病中也起著重要作用[4]。近年來的研究證實血液流變性降低、血液凝固性增強、微循環(huán)功能障礙等是瘀血致喘的病理基礎(chǔ)，故血瘀的存在, 是哮喘纏綿不愈和導致全身疾患如肺心病等的重要病機[5]。三七是臨床常用的活血化瘀中藥，具有止血、散瘀、消腫、止痛、補虛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效。而哮喘的發(fā)病又與氣道炎癥、免疫失衡和血瘀相關(guān)，因此本實驗觀察了活血化瘀中藥三七的主要成分提取物三七總皂苷(PNS)對哮喘小鼠氣道炎癥及對免疫細胞Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)作用，旨在從免疫平衡的角度尋找其作用靶點，探討PNS防治支氣管哮喘的可能作用機制。

1 實驗資料

1.1實驗動物 SPF級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由四川省醫(yī)學實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK(川)2008-24，合格證號：0012504。根據(jù)分組分籠飼養(yǎng)，可以自由進食去卵白蛋白(包括雞蛋)的飼料，自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學院實驗動物中心層流架。

1.2實驗用藥及試劑 三七總皂苷(血塞通軟膠囊)：100 mg/粒，昆明制藥集團有限公司。本實驗用劑量以該藥品推薦劑量300 mg/d為中劑量。實驗的低、中、高劑量比例為1∶2∶4。根據(jù)動物體表面積等效劑量計算方法，計算小鼠給藥劑量，算出總的用藥量。取血塞通軟膠囊1粒(100 mg)溶于25 mL生理鹽水中，作為高劑量，中、低劑量在高劑量基礎(chǔ)上做對倍稀釋。所用藥品在每次試驗前現(xiàn)配現(xiàn)用。卵清白蛋白(Ovalbu-min，OVA，Grade II&V)：美國Sigma公司；氫氧化鋁凝膠(Al(OH)3)：美國Sigma公司；醋酸地塞米松片：0.75 mg/片，重慶青陽藥業(yè)有限公司；小鼠白細胞介素-4(IL-4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：美國R&B公司；小鼠干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：美國R&B公司；無水乙醇：湖南匯虹試劑有限公司；二甲苯：湖南匯虹試劑有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液：武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器 醫(yī)用壓縮霧化吸入機：PARI BOYN08，德國百瑞有限公司；霧化箱：規(guī)格30 cm×30 cm×20 cm，自制；微量移液器：德國Eppendorf公司；電子天平：AR124CN型，美國奧豪斯；離心機：德國Eppendorf公司；冰箱：美的，廣東美的集團；電熱恒溫水浴箱：HH·W21·420型，天津市泰斯特儀器有限公司；病理切片機：德國LEICA公司；組織烘/攤片機：德國LEICA公司；光學顯微鏡：日本OLYMPUS；超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；干燥箱：QIC-3型，上海市實驗儀器總廠；SpectraMax 340PC酶標儀：美國分子儀器公司。

1.4實驗方法

1.4.1實驗分組及哮喘模型的制備 按隨機數(shù)字表法將50只BALB/c小鼠分為正常對照組、哮喘模型組及PNS低、中、高劑量組，每組10只。哮喘模型組和PNS低、中、高劑量組第1，8，15天各腹腔注射0.2 mL致敏液(含OVA 50 μg)。第22天開始，2%OVA霧化液6 mL霧化激發(fā)哮喘，1次/d，45 min/次，霧化7 d。正常對照組以生理鹽水代替OVA。實驗中觀察小鼠反應，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸深而快、腹肌抽搐、口唇發(fā)紺、頭面部瘙癢、前肢抬起撓鼻、大小便失禁、煩躁嗆咳及點頭運動等癥狀表明激發(fā)成功。結(jié)合肺組織病理學切片判斷支氣管炎癥改變情況。

1.4.2藥物干預試驗 每次激發(fā)前30 min對實驗小鼠灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d：正常對照組和哮喘模型組灌胃生理鹽水0.4 mL/只。PNS低、中、高劑量組分別給予19.5 mg/(kg·d)、39 mg/(kg·d)、78 mg/(kg·d)濃度的PNS藥液以0.4 mL/只灌胃。

1.4.3標本采集及檢測 各實驗組于最后1次激發(fā)24 h后取材。小鼠摘除眼球采血及分離血清，ELISA法檢測血清中細胞因子IL-4、IFN-γ水平。取小鼠右肺組織固定于10%甲醛液中，用于制作石蠟切片和肺組織病理學檢查。

2 結(jié) 果

2.1小鼠激發(fā)過程中的行為表現(xiàn) 在激發(fā)過程中，模型組小鼠激發(fā)后精神較差，出現(xiàn)不同程度煩躁不安，呼吸深而快，腹肌抽搐；隨著激發(fā)時間延長，精神狀態(tài)漸差，呈弓背呼吸，活動明顯減少或俯伏不動，甚至聚集成團，點頭運動，呼吸急促深快明顯，口唇發(fā)紺，頭面部瘙癢，前肢抬起撓鼻，毛色暗淡豎起，大小便失禁等。表明哮喘模型制備成功。正常對照組小鼠激發(fā)前后活動自如，精神狀態(tài)可以，毛色光澤度好，幾乎沒出現(xiàn)以上癥狀。藥物干預組小鼠癥狀、體征有不同程度減輕。

2.2各組肺組織表現(xiàn) 正常對照組小鼠肺組織氣道結(jié)構(gòu)清晰，各級支氣管管腔規(guī)則，氣道內(nèi)未見黏液分布及黏液栓形成，氣道纖毛上皮排列整齊，黏膜皺襞無水腫，無明顯的炎癥改變,見圖1。哮喘模型組小鼠肺內(nèi)細支氣管周圍有大量炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤，氣道結(jié)構(gòu)紊亂，氣道上皮增生、肥大，支氣管黏膜皺襞減少，甚至脫落，管腔狹窄，管腔內(nèi)黏液滲出物明顯增多，肺泡腔間隔擴大、增厚，周圍組織水腫及炎性細胞浸潤。表明小鼠哮喘模型建立成功，見圖2。PNS低、中、高劑量組與哮喘模型組相比，肺內(nèi)細支氣管周圍炎性細胞有所減少，各級支氣管管腔相對規(guī)則，氣道上皮黏液分泌物減少，氣道上皮形態(tài)較完整，支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤明顯減少，見圖3～5。

2.3各組小鼠血清中IFN-γ和IL-4濃度比較 PNS低、中劑量組血清IFN-γ濃度均明顯高于哮喘模型組(P<0.01和P<0.05),PNS高劑量組與哮喘模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PNS中劑量組和PNS高劑量組血清IL-4濃度明顯低于哮喘模型組(P均<0.01)，PNS低劑量組與哮喘模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 正常對照組肺組織病理表現(xiàn)(HE染色×400)

圖2 哮喘模型組肺組織病理表現(xiàn)(HE染色×400)

圖3 PNS低劑量組肺組織病理表現(xiàn)(HE染色×400)

圖4 PNS中劑量組肺組織病理表現(xiàn)(HE染色×400)

圖5 PNS高劑量組肺組織病理表現(xiàn)(HE染色×400)

表1 各組小鼠血清中IFN-γ和IL-4的濃度

注：①與哮喘模型組比較，P<0.01;②與哮喘模型組比較，P<0.05;③與正常對照組比較，P<0.01。

3 討 論

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥疾病，免疫反應在其發(fā)病機制中起重要作用[6]。Th1/Th2失衡與氣道炎癥過程是支氣管哮喘的免疫機制之一，即Th1細胞分化受到抑制，Th1細胞分泌的細胞因子IFN-γ等減少，Th2細胞優(yōu)勢應答在特應性哮喘發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[7]?；颊呓邮茏儜箪o止Th0細胞活化、增殖,分化為Th2細胞,產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、TNF-α等細胞因子,促進B細胞增殖,產(chǎn)生IgE,與肥大細胞及嗜酸性粒細胞膜上IgE Fc受體結(jié)合使細胞脫顆粒釋放組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子、各種酶類及細胞趨化因子,引起氣管收縮，發(fā)生速發(fā)型哮喘反應[8]；同時在白三烯、血小板活化因子、細胞趨化因子作用下使中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核- 巨噬細胞等炎癥細胞向氣道壁浸潤并被激活,釋放出多種炎癥遞質(zhì)引起毛細血管滲漏、黏膜水腫、上皮損傷、腺體分泌增加、氣管平滑肌收縮,從而維持、擴大哮喘氣道炎癥反應、氣道高反應性、氣道損傷[3]。治療哮喘的藥物主要有全身用激素、白三烯調(diào)節(jié)劑、長效β2受體激動劑、緩釋茶堿、色苷酸鈉、抗IgE抗體及其他有助于減輕患者癥狀的藥物等，但這些藥物都有許多毒副作用。為了尋求更好的治療方法，人們一直很重視中醫(yī)對哮喘的防治。

支氣管哮喘屬中醫(yī)學“哮證”范疇,唐容川《血證論》中有云：“內(nèi)存瘀血，氣道阻塞，不得升降而喘?！敝嗅t(yī)認為哮喘的發(fā)病過程是由于“宿痰伏肺”遇外感、飲食、情志等誘發(fā)，外邪引動伏痰，痰濁壅阻氣道，氣機阻滯，氣滯導致血瘀，瘀血內(nèi)阻，停于脈絡，阻塞氣道，使氣滯更甚，又加重瘀血，如此反復發(fā)作，耗損肺氣；肺貫心脈而朝百脈，肺氣虛衰，鼓動無力，心脈不暢，瘀血內(nèi)留，血瘀日久，新血不升，肺失所養(yǎng)，其氣更虛，更加重血瘀留滯[4]。現(xiàn)代醫(yī)學認為哮喘患者長期缺氧，導致微循環(huán)障礙，微血管痙攣后肥大細胞缺血、缺氧便分泌組胺，而組胺會引起氣管痙攣，進而引發(fā)哮喘?，F(xiàn)代藥理研究表明，活血化瘀藥物可通過改善微循環(huán)緩解氣道瘀血，因此運用中醫(yī)活血化瘀法治療哮喘可改善哮喘的癥狀[9]。

三七是臨床常用的活血化瘀中藥，主治咯血、衄血、外傷出血及跌打腫痛等。近年對三七的藥理作用研究顯示三七具有活血化瘀、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、降血脂、抗心律失常、抑制血小板聚集、保護腦缺血損傷、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、提高免疫力等作用[11-14]，且其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用已成為近年的研究熱點。

本研究結(jié)果表明活血化瘀類中藥三七的主要成分PNS對支氣管哮喘免疫平衡的恢復及抗氣道炎癥均有較好作用，可以提高Th1特征性細胞因子IFN-γ的表達，促進Th0向Th1分化；并能降低IL-4的表達，抑制Th0向Th2分化，恢復Th1/Th2平衡狀態(tài)，從而減輕氣道炎癥，起到防治哮喘作用。

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Research of molecular immune mechanism of PNS in alleviating asthmatic mouse airway inflammation lesions

ZHAO Wenjuan, CHEN Jing, XING Haijing,YUAN Jiali, HAN Niping

(Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan, China)

Objective It is to observe the effects of Panax notoginseng saponin (PNS) on the airway inflammation in asthmatic mice and Th1/Th2 related cytokines, and to fine the target from the point of immunologic balance, thus to explore the possible mechanism of PNS in preventing asthma. Methods 50 SPF level BALB/c female mice were divided into normal control group, asthma model group, PNS low, medium and high dose groups. The asthma models were established by OVA intraperitoneal injection and atomization inspired method. The pathological changes in the lung tissue of mice were observed, and the changes of serum IL-4 and IFN-γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Asthma symptoms and inflammatory cell infiltration were relieved in PNS low, medium and high dose groups, furthermore the expression of IFN-γ in serum of the mice had a increase trend, especially in low and medium dose groups (P<0.05 orP<0.01). The serum concentration of IL-4 decreased significantly in PNS medium and high dose groups (P<0.01). Conclusion PNS can relieve infiltration of inflammatory cells in lung tissue in the mice with asthma, reduce airway epithelial mucus secretion, improve airway inflammation. One of the mechanisms for PNS prevention of asthma in asthmatic mice may be by up-regulating secretion of IFN-γ, inhibiting the secretion of IL-4, thus contributing to Th0 to Th1 differentiation, inhibit Th0 to Th2, restore Th1/Th2 balance.

Panax notoginseng saponin; asthmatic mice; IL-4; IFN-γ

趙文娟，女，碩士，實驗師，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)免疫學。

韓妮萍，E-mail： nini577 @126.com

云南省應用基礎(chǔ)研究面上項目(2011FZ156);2013年云南省基礎(chǔ)研究重點項目(2013FA041)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.002

R-332

A

1008-8849(2015)04-0347-04

2014-08-08