吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進(jìn)展和復(fù)發(fā)的影響

魯 誠

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京 210009)

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·論 著·

吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進(jìn)展和復(fù)發(fā)的影響

魯 誠

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京 210009)

目的 探究吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進(jìn)展和復(fù)發(fā)的影響。方法 選取2012年1月至2014年1月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院收治的50例慢性牙周炎患者，其中吸煙者25例作為觀察組，不吸煙者25例作為對照組。抽取50例患者前臂靜脈血5 mL并離心提取血清，于血清中分別加入吸煙個體和非吸煙個體的血清200、400、800 μL至牙齦卟啉單胞菌(Pg)感染KB細(xì)胞模型，作用12 h后，使用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基對細(xì)菌進(jìn)行5～7 d的培養(yǎng)，計數(shù)細(xì)菌菌落。使用人酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒對2組患者上清液中的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)的濃度差異進(jìn)行測定。對2組血清中分別加入不同體積血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的影響和KB細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1的差異進(jìn)行分析。比較2組血清中加入相同血清量Pg內(nèi)化KB細(xì)胞及KB細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1濃度的差異。結(jié)果 加入不同體積的血清后對照組個體血清Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的菌落數(shù)均明顯小于吸煙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2組個體血清加入不同體積血清Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著吸煙組血清劑量的增加，KB細(xì)胞表達(dá)MMP-1、MMP-9、TIMP-1的質(zhì)量濃度增加，不同體積的血清引起MMP-1、MMP-9、TIMP-1表達(dá)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)加入800 μL吸煙組血清與加入800 μL非吸煙組血清比較，KB細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1的質(zhì)量濃度均明顯升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 吸煙個體的血清能夠促進(jìn)Pg內(nèi)化KB細(xì)胞產(chǎn)生MMP-1、MMP-9、TIMP-1，促進(jìn)慢性牙周炎的進(jìn)展和復(fù)發(fā)。

吸煙； 慢性牙周炎； 基質(zhì)金屬蛋白酶類

慢性牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的感染性疾病，是常見的牙齒支持組織多發(fā)疾病[1]。臨床主要表現(xiàn)為牙齦組織的炎性水腫出血，同時齦下菌斑和其產(chǎn)物對宿主細(xì)胞產(chǎn)生刺激并釋放出多種炎性介質(zhì)，同時與宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)協(xié)同作用促進(jìn)牙槽骨的吸收[2]。煙草中的尼古丁和可替丁能夠促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌(Pg)黏附及侵入KB細(xì)胞這一過程，進(jìn)而引起并促進(jìn)牙周炎的發(fā)展[3]。因此，使用吸煙個體的血清替代齦溝液能夠全面地反映煙草在Pg內(nèi)化牙齦上皮細(xì)胞中的作用?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年1月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院收治的50例慢性牙周炎患者，其中吸煙者25例，年齡45～75歲，平均(57.3±11.4)歲。不吸煙者25例，年齡為47～78歲，平均(55.3±10.2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床診斷為慢性牙周炎患者。(2)3個月內(nèi)未使用過抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑等。(3)已簽署知情書并自愿參加本項研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者。(2)合并多種急慢性疾病或免疫系統(tǒng)疾病者。(3)嚴(yán)重精神疾患者者。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) (1)抽取患者前臂靜脈血5 mL離心后收集血清，保存于-80 ℃。(2)常溫復(fù)蘇后，接種于新鮮配置的含1%氯化血紅蛋白、5%無菌脫纖維羊血、0.1%維生素K1的腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃的厭氧環(huán)境中培養(yǎng)5～7 d。(3)革蘭氏染色和生化鑒定為Pg ATCC33277純培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)在4 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，并使用5 000 r/min的速率離心10 min收集細(xì)菌，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后，重懸在無抗生素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液中，使用紫外分光光度計測量600 nm處的吸光度值，然后調(diào)節(jié)菌懸液至1×108CFU/mL作備用。(4)細(xì)菌液體在增菌后采取抽簽法抽取15個樣本，對這些樣本進(jìn)行革蘭氏染色后使用PCR法鑒定Pg。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在低糖DMEM中接種常規(guī)復(fù)蘇KB細(xì)胞株ATCCCCL17，飽和適度為50 mL/L CO2和37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)傳代1～2代。在顯微鏡下可以觀察到此時細(xì)胞形態(tài)為“鋪路石”狀，在瓶底80%～90%長滿時使用含乙二胺四乙酸(EDTA)的2.5 g/L的胰蛋白酶進(jìn)行消化，并對細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)行計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×108/L，使用2.5 mL低糖DMEM接種于6孔板上，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后確保細(xì)胞為貼壁狀態(tài)。

1.2.3 計數(shù)細(xì)菌菌落數(shù) 貼壁狀態(tài)的KB細(xì)胞長滿6孔板的80%～90%時，細(xì)胞的數(shù)量計數(shù)結(jié)果為2.5×106個/孔，使用PBS 沖洗3次后，更換低糖DMEM并加入2.5×108CFU/mL Pg，確保感染復(fù)數(shù)為100∶1，不加入Pg的孔為陰性對照。在觀察組和對照組患者的血清中分別加入非吸煙個體和吸煙個體的血清200、400、800 μL至Pg感染KB細(xì)胞模型，不加入任何個體血清的孔為陰性對照。共同孵育2 h后每個樣本形成3個負(fù)孔，使用PBS沖洗3次后以清除未黏附到KB細(xì)胞的Pg，加入含有抗生素的DMEM孵育1 h，使用PBS洗滌4次，12 h后充分吸收500 μL上清液，在-80 ℃環(huán)境下保存。剩余的DMEM扔掉后，使用PBS沖洗4次，在每個孔中加入1 mL滅菌雙蒸水裂解細(xì)胞90 min后將懸液等比稀釋，取100 μL接種于新鮮配制的含1%氯化血紅蛋白、5%無菌脫纖維羊血、0.1%維生素K1的腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d，計數(shù)細(xì)菌菌落。

1.2.4 檢測方法 按照MMP-1、MMP-9、TIMP-1試劑盒說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀(瑞士，Infinite M200，Tecan company)對每個孔450 nm處的吸光度值進(jìn)行測定，使用MasterPlex2010軟件將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制出來，并計算相應(yīng)的吸光度值對應(yīng)的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 2組不同體積血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞菌落數(shù)的影響 研究結(jié)果顯示，加入不同體積的血清后對照組個體血清Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的菌落數(shù)均明顯小于吸煙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2組個體血清加入不同體積血清Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的菌落數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組不同體積血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞菌落數(shù)的影響

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.2 2組血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞過程中產(chǎn)生MMP-1的作用 研究結(jié)果顯示，隨著吸煙個體血清體積的增加KB細(xì)胞表達(dá)MMP-1的質(zhì)量濃度增加，而非吸煙個體的血清對KB細(xì)胞表達(dá)MMP-1的影響不大。當(dāng)加入200 μL血清時，2組血清中KB細(xì)胞分泌MMP-1的質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)加入400和800 μL血清時，2組血清中KB細(xì)胞分泌MMP-1的質(zhì)量濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞過程中產(chǎn)生MMP-1的作用

注：t1為加入Pg的觀察組與對照組相比較；t2為不加入Pg的觀察組與對照組相比較。與加入Pg的對照組相比,△P<0.05。-表示無數(shù)據(jù)。

2.3 2組血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞過程中產(chǎn)生MMP-9的作用 研究結(jié)果顯示，隨著吸煙個體血清體積的增加KB細(xì)胞表達(dá)MMP-9的質(zhì)量濃度增加，而非吸煙個體的血清對KB細(xì)胞表達(dá)MMP-9的影響不大。當(dāng)加入200和400 μL血清時，2組血清中KB細(xì)胞分泌MMP-9的質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)加入800 μL血清時，2組血清中KB細(xì)胞分泌MMP-9的質(zhì)量濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4 2組血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞過程中產(chǎn)生TIMP-1的作用 研究結(jié)果顯示，隨著吸煙個體血清體積的增加KB細(xì)胞表達(dá)TIMP-1的質(zhì)量濃度增加，而非吸煙個體的血清對KB細(xì)胞表達(dá)TIMP-1的影響不大。當(dāng)加入200 μL血清時，2組血清中KB細(xì)胞分泌TIMP-1的質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)加入400和800 μL血清時，2組血清中KB細(xì)胞分泌TIMP-1的質(zhì)量濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 2組血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞過程中產(chǎn)生MMP-9的作用

注：t1為加入Pg的觀察組與對照組相比較；t2為不加入Pg的觀察組與對照組相比較。與加入Pg的對照組相比，△P<0.05。-表示無數(shù)據(jù)。

表4 2組血清對Pg內(nèi)化KB細(xì)胞過程中產(chǎn)生TIMP-1的作用

注：t1為加入Pg的觀察組與對照組相比較；t2為不加入Pg的觀察組與對照組相比較。為與加入Pg的對照組相比較，△P<0.05;與不加入Pg的對照組相比，*P<0.05。-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

Pg能夠侵入到宿主細(xì)胞的上皮細(xì)胞中并存活在其中，在一定的條件下Pg能夠游移出細(xì)胞，促進(jìn)慢性牙周炎的復(fù)發(fā)[4]。MMP是一族能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅離子依賴性蛋白水解酶，MMP-1是一種成纖維細(xì)胞型膠原酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中最為豐富的膠原，促進(jìn)微生物感染向深部組織的擴(kuò)散運(yùn)動[5]。MMP-9是一種降解基底膜的重要蛋白酶，是由各種基質(zhì)細(xì)胞保持酶原的形式在細(xì)胞內(nèi)合成的，最終分泌到細(xì)胞外側(cè)，對骨吸收和骨組織的重建發(fā)揮作用[6]。TIMP是一種相對分子質(zhì)量為2.9×104的糖蛋白，能夠調(diào)節(jié)和抑制已經(jīng)被激活的MMP-9、MMP-1[7]。因此，在機(jī)體內(nèi)的MMP和TIMP之間的分泌與降解過程中保持著穩(wěn)定的關(guān)系，這種平衡穩(wěn)定的關(guān)系能夠維護(hù)牙周組織的健康，但是煙草內(nèi)有害物質(zhì)的作用會打破MMP和TIMP的平衡狀態(tài)[8]。本文通過模擬慢性牙周炎患者在吸煙和非吸煙個體血清中的存在條件，Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的數(shù)量，對2種個體血清對KB細(xì)胞分泌的MMP-9、MMP-1、TIMP-1濃度的影響進(jìn)行了探究，進(jìn)而探究了吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進(jìn)展和復(fù)發(fā)的影響。

吸煙者的口腔衛(wèi)生一般較差，牙面多堆積菌斑，且形成較多的牙石，舌側(cè)齦退縮，由于尼古丁對牙齦血管的收縮產(chǎn)生刺激作用，造成其血流量減少，同時吸煙使牙齦角化變厚，在牙齦下構(gòu)成特定的牙周病原體，對某些藥物對特定牙周致病菌的抑制作用產(chǎn)生影響，因而吸煙者牙齦下對特定致病菌的感染率較高。本文研究結(jié)果顯示，患有慢性牙周炎的吸煙個體預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率較高。這與王宏巖等[9]研究結(jié)果相同。這是由于煙草中的尼古丁和可替丁會對包括PgfimA在內(nèi)的58中基因表達(dá)產(chǎn)生影響，而fimA基因?qū)?xì)菌黏附和侵入的過程發(fā)揮著重要作用，fimA基因表達(dá)上調(diào)后能夠有利于Pg對KB細(xì)胞的侵入[10]。而不同濃度的尼古丁和可替丁還能夠調(diào)節(jié)RagA等相對分子質(zhì)量的表達(dá)，而這些相對分子質(zhì)量的表達(dá)上調(diào)會促使細(xì)菌產(chǎn)生更多的能量和毒力來維持細(xì)菌內(nèi)化細(xì)胞的進(jìn)程[11]。同時吸煙會降低多形核白細(xì)胞(PMN)的吞噬能力和趨化性，減少患者機(jī)體的單核細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，當(dāng)炎性反應(yīng)發(fā)生時，PMN和淋巴細(xì)胞等就不能有效地殺傷、吞噬和降解組織碎片和病原微生物，導(dǎo)致繼發(fā)性和原發(fā)性的免疫能力低下。而本項研究中，加入不同量的吸煙者個體的血清后，與非吸煙者個體血清相比促進(jìn)了Pg內(nèi)化KB細(xì)胞的數(shù)量，并且隨著加入血清量的增多這種差異也越明顯。造成這種現(xiàn)象的原因可能為血清中的某些煙草成分通過上調(diào)Pg的某些蛋白或基因，上調(diào)了Pg侵入細(xì)胞的能力和毒力作用，也可能是由于煙草成分加速了上皮細(xì)胞的膠原降解而使促進(jìn)了細(xì)菌的侵入，具體原因還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。同時煙草能夠通過造成局部缺氧環(huán)境使MMP和TIMP的表達(dá)增高。本文中加入大劑量吸煙個體血清時，KB細(xì)胞分泌的MMP-1和MMP-9的濃度也明顯升高，TIMP-1的濃度也隨之升高，這可能是由于隨著MMP-1和MMP-9的分泌增多，KB細(xì)胞代償性的分泌TIMP-1，來保持機(jī)體內(nèi)MMP和TIMP的相對平衡狀態(tài)，進(jìn)而保持局部組織的相對穩(wěn)定和健康的狀態(tài)[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)吸煙組患者在進(jìn)行局部檢查時其指標(biāo)存在較大的個體差異，這進(jìn)一步說明吸煙是牙周炎的重要危險因素，但牙周炎是一種多因素誘發(fā)的疾病，這些因素互相拮抗且互相影響，在不同的環(huán)境和宿主中產(chǎn)生較大的影響，因此臨床中采用牙周治療能夠改善口腔衛(wèi)生狀況去除致病因素，這種治療方法對吸煙者和不吸煙者均能夠發(fā)揮較佳的臨床療效。

綜上所述，吸煙個體的血清能夠促進(jìn)Pg內(nèi)化KB細(xì)胞產(chǎn)生MMP-1、MMP-9、TIMP-1，促進(jìn)慢性牙周炎的進(jìn)展和復(fù)發(fā)。也就是說吸煙患者的口腔環(huán)境會導(dǎo)致Pg發(fā)揮致病作用，進(jìn)而促進(jìn)慢性牙周炎進(jìn)展和復(fù)發(fā)。

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Influence of smoking on disease progression and relapse in elderly patients with chronic periodontitis

LUCheng

(AffiliatedStomatologicalHospital,MedicalCollegeofNanjingUniversity,Nanjing,Jiangsu210009,China)

Objective To investigate the influence of smoking on disease progression and recurrence in elderly patients with chronic periodontitis.Methods 50 cases of chronic periodontitis patient in our hospital from January 2012 to January 2014 were selected,among them 25 cases of smoking were taken as the observation group and 25 cases of non-smoking as the control group.5mL of forearm blood was collected in 50 patients and centrifuged for extracting serum.The serum 200,400,800 μL in smoking individual and non-smoking individuals were added to porphyromonas gingivalis(Pg) infecting the KB cell model,after 12 h action,the brain heart infusion agar medium was used for conducting 5-7 d bacterial culturing and the bacterial colonies were counted.The human enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit was used to detect the concentration differences of matrix metalloproteinases(MMP)-1,MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP-1) in the supernatant of two groups.The influence of adding different volumes of serum on the Pg internalizing KB cells and the differences of KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 were analyzed.In adding the same volume of serum,Pg internalizing KB cells and difference of KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 were compared between the two groups.Results After adding different volumes of serum,the colonies of Pg internalizing KB cells in control group individual serum were significantly less than those in the smoking group,the difference was statistically significant(P<0.05).In adding different volumes of serum in the two groups individual serum,the difference of colonies number of Pg internalizing KB cells were statistically significant(P<0.05).With increasing doses of serum in the smoking group,KB cells expressed MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 concentrations were increased,the MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 expression differences caused by different volumes of serum were statistically significance(P<0.05).Comparing adding 800 μL of smoking group serum with 800 μL of non-smoking group serum,KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 concentrations were significantly increased(P<0.05).Conclusion Smoking individual serum can contribute to Pg internalizing KB cells to produce MMP-1,MMP-9 and TIMP-1,thus promote the progression and recurrence of chronic periodontitis.

smoking; chronic periodontitis; matrix metalloproteinases

魯誠，男，主治醫(yī)師，本科，主要從事口腔修復(fù)相關(guān)方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.026

A

1672-9455(2015)15-2204-04

2015-02-16

2015-04-15)