核酸適配體修飾的鐵納米粒對(duì)EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的靶向熱療效應(yīng)

于連元，胡 燕*，段金虹，許海燕，楊先達(dá)*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所1.病理學(xué)與病理生理學(xué)系;2.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，北京100005)

表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)在腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、分化等生理學(xué)過(guò)程中起重要作用。它在許多腫瘤表面過(guò)表達(dá)，如上皮樣惡性腫瘤、惡性膠質(zhì)瘤、肺癌、胰腺癌、人膠質(zhì)細(xì)胞瘤，使其成為腫瘤治療中一種重要的靶向分子。目前針對(duì)EGFR 陽(yáng)性腫瘤的靶向治療手段主要依賴單克隆抗體和小分子抑制劑，但患者接受這些治療后容易產(chǎn)生免疫耐受，降低治療效果，因此急需要一種新型的針對(duì)EGFR 陽(yáng)性腫瘤的靶向治療手段。鐵納米?？梢栽诮蛔兇艌?chǎng)中吸收熱量，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，但這種效果缺乏靶向性。核酸適配體是經(jīng)過(guò)篩選得到的單鏈寡聚核苷酸，是一種新型的靶向分子，與抗體相比其具有免疫原性低、制備成本低、易于修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛研究于腫瘤的診斷和靶向治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物素與鏈霉素反應(yīng)，將針對(duì)EGFR 的核酸適配體［1-2］與鐵納米粒結(jié)合，構(gòu)建核酸適配體修飾的鐵納米粒，并首次探索了其對(duì)EGFR 陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的熱療調(diào)節(jié)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U251)和人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)，鐵納米粒(Promaga 公司)，親和素修飾物、FAM 修飾物(Invitrogen 公司)，Taq 酶和dNTPs(Genstar 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):U251 和MDA-MB-231 培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(高糖型)。兩種細(xì)胞系培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的孵箱中。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均使用對(duì)數(shù)增殖期間的細(xì)胞。

1.2.2 Apt-NP 的構(gòu)建:PCR 獲得P1-biotin 修飾的雙鏈EGFR 核酸適配體(95 ℃，40 s;55 ℃，30 s;72 ℃，40 s;25 個(gè)循環(huán))，混合60 pmol 的PCR 產(chǎn)物和100 μL 鏈霉素修飾的鐵納米粒，室溫下振蕩15 min，PBS 洗滌3 次，加40 mmol NaOH 振蕩5 min，磁鐵吸附后棄去上清，加100 μL PBS 重懸。

1.2.3 流式檢測(cè):PCR 獲得P1-FAM 修飾的雙鏈EGFR 核酸適配體?；旌?0 pmol PCR 產(chǎn)物與20 μL磁珠，室溫下振蕩15 min，PBS 洗滌3 次，加40 mmol NaOH 振蕩5 min，磁鐵吸附后取上清，加入100 mmol鹽酸中和至pH 呈中性，混勻。分別于U251 和MDMBA-231 細(xì)胞孵育30 min，PBS 洗滌3 次，200 μL PBS 重懸后，進(jìn)行流式檢測(cè)。

混合40 pmol FAM 標(biāo)記的EGFR DNA 雜交探針與40 μL Apt-NP 混勻，室溫下振蕩15 min，PBS洗滌3 次后重懸，進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.4 表征檢測(cè):分別吸取10 μL Apt-NP 以及NP，雙蒸水稀釋至1 mL，在動(dòng)態(tài)光散射儀下分別檢測(cè)其尺寸分布。

1.2.5 吸光度值檢測(cè):U251 和MD-MBA-231 細(xì)胞分別接種于6 孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)。分別加入100 μL Apt-NP 或未修飾的鐵納米粒(NP)，37 ℃ 孵育30 min，PBS 洗滌3 次，室溫下普魯士藍(lán)染液反應(yīng)20 min，PBS 洗滌2 次，酶標(biāo)儀檢測(cè)760 nm 吸收波長(zhǎng)。

1.2.6 Apt-NP 熱療效率檢測(cè):U251 和MD-MBA-231 細(xì)胞分別接種6 孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，分別加入100 μL Apt-NP、100 μL 未修飾的鐵納米粒、60 pmol游離的核酸適配體。37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌2次，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，在交變磁場(chǎng)中孵育5 h，取上清于96 孔板中，加入乳酸脫氫酶試劑盒中的反應(yīng)液反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 吸收波長(zhǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

多樣本數(shù)據(jù)采用方差分析，用SPSS 分析各組數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 核酸適配體的結(jié)合性質(zhì)

在EGFR 陽(yáng)性的U251 細(xì)胞中，EGFR 核酸適配體(EGFR-Apt)熒光強(qiáng)度較隨機(jī)DNA(Random)明顯增強(qiáng)，曲線右移(圖1A 黑色);在MDA-MB-231 細(xì)胞中，EGFR 核酸適配體與隨機(jī)DNA 的熒光強(qiáng)度基本相同，沒(méi)有明顯位移(圖1B)。

2.2 Apt-NP 的構(gòu)建

相比于對(duì)照，DNA 探針處理過(guò)的鐵納米粒熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，曲線右移(圖2A 黑色);而未修飾的鐵納米粒熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化，曲線沒(méi)有明顯位移(圖2B)。

2.3 Apt-NP 的尺寸表征

Apt-NP 的平均直徑為574 nm，呈單峰分布，未修飾的游離鐵納米粒的平均直徑為400 nm(圖3)。

2.4 Apt-NP 特異性地結(jié)合EGFR 陽(yáng)性細(xì)胞

Apt-NP 處理過(guò)的U251 細(xì)胞中吸光度值較高，而Apt-NP 處理過(guò)的MDA-MB-231 細(xì)胞中吸光度值較低(P＜0.05);未修飾的鐵納米粒在兩組細(xì)胞的吸光度值均較低(圖4)。

圖1 EGFR 核酸適配體結(jié)合特異性的流式分析Fig 1 The bindings of the EGFR aptamer to U251 cells and MDA-MB-231 cells

圖2 DNA 雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Apt-NP 的構(gòu)建Fig 2 The binding of FAM-labeled DNA probes to Apt-NP and blank NP

圖3 動(dòng)態(tài)光散射評(píng)估Apt-NP 尺寸Fig 3 Size distribution analysis of Apt-NP

2.5 Apt-NP 對(duì)熱療效果的靶向調(diào)節(jié)作用

Apt-NP 能顯著提升對(duì)EGFR 陽(yáng)性U251 腫瘤細(xì)胞的熱療殺傷效率(P＜0.05)，而NP 和APT 均沒(méi)有此作用;在MDA-MB-231 細(xì)胞組中，Apt-NP、NP、APT 均沒(méi)有提升熱療效率的作用，說(shuō)明Apt-NP 可以靶向性的提升針對(duì)EGFR 陽(yáng)性U251 腫瘤細(xì)胞的熱療殺傷作用(圖5)。

圖4 普魯士藍(lán)染色吸光度值檢測(cè)Fig 4 The attachment of Apt-NP and NP to U251 cells or MDA-MB-231 cells measured by absorption at 760 nm(±s)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一個(gè)核酸適配體修飾的鐵納米粒復(fù)合體(Apt-NP)，尺寸為574 nm，呈單峰分布，對(duì)U251 腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)結(jié)合，而對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞基本沒(méi)有結(jié)合。此外，Apt-NP 可以顯著的提高EGFR 陽(yáng)性U251 腫瘤細(xì)胞的熱療殺傷效率，而對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的熱療殺傷效率基本沒(méi)有影響。

本實(shí)驗(yàn)首次將EGFR 適配體與鐵納米粒結(jié)合并用來(lái)提升對(duì)EGFR 陽(yáng)性的U251 腫瘤細(xì)胞的靶向熱療殺傷效率。EGFR 的過(guò)度激活能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖不受控制，在多種惡性腫瘤中有高表達(dá)，包括人膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等。

圖5 Apt-NP 對(duì)EGFR 陽(yáng)性U251 細(xì)胞熱療效應(yīng)的影響Fig 5 Apt-NP enhanced the thermal damage to the U251 cells but not the MDA-MB-231 cells(±s，n=8)

此外，隨著EGFR 激活的增多，細(xì)胞凋亡減少，血管生成增加，EGFR 的突變還與人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［1］。針對(duì)EGFR 的靶向治療是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，主要治療手段有單克隆抗體，如西妥昔單抗和帕尼單抗，以及小分子抑制劑如吉非替尼、埃羅替尼和拉帕替尼［3-6］，但是這些療法容易使患者產(chǎn)生耐藥性，因此需要研發(fā)全新的針對(duì)EGFR 的靶向治療手段［7-8］。腫瘤熱療是通過(guò)升高體溫或局部加溫，改變腫瘤細(xì)胞所處的環(huán)境，并使其變性、壞死，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，被稱為綠色治療方法。傳統(tǒng)熱療中所使用的金屬熱敏劑不具有靶向性，分散組織中會(huì)減少其有效濃度，降低治療效果，并增加對(duì)非病變組織的殺傷。Apt-NP 可以特異性地結(jié)合EGFR 陽(yáng)性的U251 腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)其的熱療效率，減少對(duì)非病變組織的殺傷，在EGFR 陽(yáng)性腫瘤的靶向熱療治療方面有潛在應(yīng)用價(jià)值，有關(guān)核酸適配體的優(yōu)化和此方法的進(jìn)一步應(yīng)用有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。

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