食管鱗癌中Klf17蛋白表達及其對Eca109細胞遷移和侵襲能力的影響

王聰懿，張 誠，羅 駿，吳慶琛

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶400010)

食管鱗癌是中國最常見的消化道惡性腫瘤之一，但其病因和發(fā)病機制尚不明確，可能與原癌基因激活、抑癌基因失活相關(guān)［1］。KLF17 作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與細胞生長、分化、及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等生理或病理過程有著密切關(guān)系［2］。本研究意在通過觀察食管鱗癌組織中KLF17 蛋白表達與臨床病例特征的關(guān)系探討KLF17 在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的作用，以及過表達KLF17 基因?qū)ca109 細胞遷移、侵襲能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病例資料:選取2012年6月至2013年3月重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)過放化療的食管鱗癌患者腫瘤及癌旁(腫瘤外5 cm)新鮮術(shù)后組織標本共81 例，進行石蠟包埋切片，其中食管鱗癌組:44 例，男32 例，女12 例，年齡41～79 歲，平均年齡(54.3 ±7.2)歲;癌旁正常組:37 例，男26例，女11 例，年齡41～79 歲，平均年齡(52.8 ±9.3)歲。所有標本均經(jīng)TNM 分期、分化程度、年齡、性別等歸類。所選患者均知情同意。

1.1.2 細胞與慢病毒:Eca109 細胞由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤實驗室保存，在含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。過表達KLF17的慢病毒載體設(shè)計、構(gòu)建和包裝(上海吉凱基因生物公司)。

1.1.3 主要試劑:KLF17 兔抗人多克隆抗體(Abcam 公司);E-cadherin 和N-cadherin 兔抗人多克隆抗體(Cell Signal 公司);總RNA 提取試劑盒、RTPCR 試劑盒及實時熒光定量試劑盒SYBRPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara 公司);BCA 蛋白濃度測定試劑盒、HRP 標記山羊抗兔IgG、細胞裂解液、PMSF、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒和5 × SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液(碧云天公司);ECL 發(fā)光試劑盒(Thermo Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色:切片經(jīng)二甲苯脫水，梯度乙醇復(fù)水，枸櫞酸高溫抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷，PBS沖洗3 次，分別加入一抗及二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明。以PBS 代替一抗做陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。結(jié)果判定:以胞質(zhì)中染色強度淺黃、棕黃、棕褐色分別評為1、2 和3 分，以染色的細胞比例＜10%、10%～30%、30%～50%和＞50%分別評為0、1、2 和3 分?？傮w評分值=染色強度×染色細胞比例。評分:≤3 分為陰性表達，4～9 分為陽性表達。

1.2.2 慢病毒的轉(zhuǎn)染與實驗分組:用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)細胞，當處于對數(shù)期增殖時將其傳代，以MAI 值0、10、20、30、40、50 和60 時分別加入空載體慢病毒，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株后，將Eca109 細胞分為3組:CON 組(未進行處理的Eca109 細胞);Ad-GFP組(用空白病毒轉(zhuǎn)染的Eca109 細胞);Ad-KLF17 組(過表達KLF17 慢病毒載體轉(zhuǎn)染的Eca109 細胞)。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測:待細胞呈匯合狀態(tài)時，分別收集各組細胞，按照說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，熒光定量PCR 采用SYBR 說明書10 μL 體系及反應(yīng)條件。相對基因表達分析采用2－ΔΔCt法，實驗重復(fù)3 次。

1.2.4 Western blot 檢測:裂解細胞后，4 ℃12 000 r/min離心5 min，BCA 法測定蛋白濃度，加SD 上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，取40 μg 總蛋白，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉的TBST 中室溫封閉1 h 后加入一抗，4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗滌3 次×10 min，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次×5 min，ECL 發(fā)光液發(fā)光，X 片壓片處理后，掃描。Quantity One 檢測吸光度值，以目的蛋白/內(nèi)參照吸光度值表示。該實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 細胞劃痕實驗:取對數(shù)增殖期的3 組Eca109 細胞，以每105個/孔種于6 孔板的3 孔并標記，待細胞為結(jié)合狀態(tài)時，在6 孔板背面用記號筆劃10 根平行線做標記，200 μL 槍頭在細胞中間劃條垂直于背面平行線的直線，PBS 沖洗2 次，加入2 mL含1%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，細胞的愈合能力用于檢測遷移能力。用倒置顯微鏡分別于0 和48 h觀察并拍照，Image J 分別測量細胞遷移距離，取5組隨機數(shù)據(jù)計數(shù)。實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 體外Transwell 侵襲實驗:Matrigel 與無血清1640 以1∶8 配比100 μL 鋪在24 孔板上的小室中，置于37 ℃孵箱6 h。將各組細胞胰蛋白酶消化后，用無血清1640 分別制成5 000 個/100 μL 細胞種于上室，下室加入800 μL 含10%血清的1640，孵育24 h 后，PBS 清洗3 次，甲醇室溫固定30 min，自然風干，每孔加入0.25%結(jié)晶紫溶液染色10～15 min，PBS 清洗3次，棉球小心將上層小室內(nèi)細胞擦凈，顯微鏡下觀察侵襲的細胞數(shù)目，取5 個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 KLF17 蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

KLF17 蛋白表達在腫瘤組織中明顯低于癌旁正常組織(P＜0.05)(表1，圖1)。與腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期顯著相關(guān)(P＜0.05)(表2)。

表1 KLF17 在44 例食管鱗癌組織及37 例癌旁組織的表達差異Table 1 Different expression of KLF17 in 44 esophageal squamous cell carcinoma tissues and 37 paracarcinoma tissues

2.2 慢病毒對Eca109 細胞轉(zhuǎn)染效率

MAI 為0、10、20、30、40、50 和60 時，96 h 感染效率分別為0%、10%、30%、50%、80%、＞95%和＞99%。當MAI 值為50 時，轉(zhuǎn)染效率高，細胞狀態(tài)較好，故選擇MAI 值50 轉(zhuǎn)染細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 食管癌及癌旁組織中KLF17 的表達Fig 1 Expression of KLF17 in esophageal cancer tissues and that of adjacent to carcinoma(×200)

表2 KLF17 在腫瘤組織中的表達與臨床病理資料的數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Data statistics of clinicopathologic data and expression of KLF17 in tumor tissue

2.3 慢病毒對Eca109 細胞中KLF17 mRNA、蛋白表達的影響

Ad-KLF17 組KLF17 mRNA 表達明顯高于對照組及Ad-GFP 組，KLF17 蛋白Ad-KLF17 組表達明顯高于對照組及Ad-GFP 組(P＜0.05)(圖2，表3)。

圖2 病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞KLF17 蛋白的表達Fig 2 Expression of KLF17 protein in lentivirus group of cells after transfection

2.4 KLF17 抑制Eca109 細胞的遷移能力

Ad-KLF17 組細胞劃痕48 h 后遷移距離為(137.2 ±8.2)μm，對照組為(221.4 ±25.9)μm，Ad-GFP 組為(228.6 ±22.5)μm。Ad-KLF17 組細胞遷移距離明顯比對照組和Ad-GFP 組短(P＜0.05)(圖3)。

表3 各組細胞KLF17 mRNA 及蛋白表達量Table 3 Expression index of KLF17 mRNA and protein in groups of cells(±s，n=3)

表3 各組細胞KLF17 mRNA 及蛋白表達量Table 3 Expression index of KLF17 mRNA and protein in groups of cells(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with control group.

groupKLF17 mRNAKLF17 protein CON1.354 ±0.2230.155 ±0.008 Ad-GFP1.000 ±0.1830.158 ±0.011 Ad-KLF1711.229 ±1.909*1.095 ±0.077*

2.5 KLF17 抑制Eca109 細胞的侵襲能力

Ad-KLF17 組侵襲24 h 穿過小孔的細胞數(shù)為(27 ±3)個，顯著低于對照組(58±5)個、Ad-GFP 組(54±4)個(P＜0.05)，Ad-KLF17 組穿過小孔的細胞數(shù)明顯比兩個對照組少(P＜0.05)(圖4)。

2.6 慢病毒對Eca109 細胞中E-cadherin 及Ncadherin 蛋白表達的影響

Ad-KLF17 組E-cadherin 表達明顯高于對照組及Ad-GFP 組，Ad-KLF17 組N-cadherin 蛋白表達明顯低于對照組及Ad-GFP 組(P＜0.05)(圖5，表4)。

3 討論

KLF 家族屬于鋅指蛋白家族，它們均對細胞的侵襲和增殖起重要作用［3-4］。低表達KLF17 的乳腺癌、肝癌細胞遷移侵襲能力明顯增強，并加速上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，KLF17 表達的缺失對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用［5-7］。EMT 通過抑制腫瘤細胞的穩(wěn)定性、改變腫瘤細胞活動性、增強腫瘤細胞侵襲力等來影響腫瘤細胞的生物學特征［8］。近年，在上皮組織及間質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn)了許多標志性的基因［9］，N-cadherin 和E-cadherin 為其中兩個有代表性的標志物。N-cadherin 能使腫瘤細胞之間的黏附力下降，可增加細胞的遷移和侵襲能力［10］。E-cadherin 下調(diào)能伴隨N-cadherin 上調(diào)，引起細胞的穩(wěn)定性下降，使細胞之間的連接能力下降［11］。

圖3 劃痕實驗48 h 后各組細胞的遷移情況Fig 3 The migration of each group of cells after 48 hours scarification test(×100)

圖4 Transwell 侵襲實驗各組細胞24 h 穿過小室的細胞數(shù)Fig 4 Comparison of passing cell numbers in 24 hours Transwell invasion assay(×200)

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達Fig 5 The protein expression of E-cadherin and N-cadherin after lentivirus transfection

表4 各組細胞E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達量Table 4 Expression index of E-cadherin and N-cadherin protein in groups of cells(±s，n=3)

表4 各組細胞E-cadherin 及N-cadherin 蛋白表達量Table 4 Expression index of E-cadherin and N-cadherin protein in groups of cells(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with control and Ad-GFP group.

groupE-cadherinN-cadherin CON0.252 ±0.0330.242 ±0.020 Ad-GFP0.273 ±0.0150.228 ±0.020 Ad-KLF170.447 ±0.020*0.111 ±0.014*

本實驗發(fā)現(xiàn)，KLF17 在食管鱗癌中的表達明顯低于癌旁正常組織的表達(P＜0.05)。KLF17 的表達與腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期呈負相關(guān)。KLF17 對于食管鱗癌的遷移、侵襲等作用可能存在著抑制作用。過表達KLF17 后，E-cadherin 蛋白明顯增高，而N-cadherin 明顯降低。細胞劃痕遷移距離明顯縮短，細胞穿過Transwell 膜小孔的數(shù)目也明顯減少。這些提示KLF17 上調(diào)后Eca109細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，Eca109 細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用可能隨之減弱。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)KLF17 的蛋白表達與食管鱗癌病理資料密切相關(guān)，對食管鱗癌發(fā)生發(fā)展起重要作用，KLF17 對Eca109 細胞發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)化可能發(fā)揮著重要作用，為臨床運用推廣提供一定的理論基礎(chǔ)。

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