真菌性陰道炎患者的假絲酵母菌感染及耐藥性研究

楊 柳，李鵬宇，王 智

(武警北京總隊醫(yī)院檢驗科，北京 100027)

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·論 著·

真菌性陰道炎患者的假絲酵母菌感染及耐藥性研究

楊 柳，李鵬宇，王 智

(武警北京總隊醫(yī)院檢驗科，北京 100027)

目的 探討真菌性陰道炎假絲酵母菌的感染及其耐藥性。方法 選取2011年11月至2014年12月該院128例真菌性陰道炎患者，分離其陰道分泌物中的假絲酵母菌并進行耐藥性檢測；采用實時定量-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測和比較咪康唑敏感株、中介株和耐藥株的多藥耐藥基因MDR1、FLU1、CDR1的表達水平。結(jié)果 128例患者共分離出132株(6種)，84例(63.64%)檢測出假絲酵母菌，4例(3.13%)患者有2種菌株的重疊感染。特比萘芬的耐藥率為44.70%，制霉菌素的耐藥率為0.00%，敏感率為96.21%。3組菌株的MDR1和FLU1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但CDR1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 真菌性陰道炎的假絲酵母菌感染呈現(xiàn)復(fù)雜化趨勢，臨床應(yīng)根據(jù)患者具體情況選擇抗菌藥物。

真菌性陰道炎； 假絲酵母菌； 耐藥性

真菌性陰道炎是由假絲酵母菌(又稱白色念珠菌)感染引起的外陰陰道炎性[1]。隨著廣譜抗菌藥物、激素、化療藥物等的大量應(yīng)用，真菌性陰道炎的發(fā)病率逐漸升高[2]。同時，感染菌株的變化和耐藥細菌的出現(xiàn)對其治療帶來困難[3]。現(xiàn)通過分析128例真菌性陰道炎患者的假絲酵母菌感染情況及其耐藥性，為臨床提供實驗室數(shù)據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年11月至2014年12月該院婦產(chǎn)科收治的128例真菌性陰道炎患者，年齡19～61歲，平均年齡(39.5±13.9)歲。本研究經(jīng)過倫理委員會審批和患者知情同意。

1.2 標本采集 嚴格按照婦科檢查的操作規(guī)范采集患者陰道后穹隆分泌物，消毒患者外陰，使用消毒的窺陰器擴張患者陰道，將專用的11093461號無菌棉拭子(深圳市華晨陽科技有限公司)經(jīng)陰道置于后穹隆，采集分泌物后于無菌試管中，標記送檢。

1.3 病原菌檢測及耐藥性分析 將標本接種于TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基(天津市金章科技發(fā)展有限公司)上培養(yǎng)，35 ℃ 5%的CO2恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，對可疑菌株進行快速革蘭染色(上海遠慕生物科技有限公司)并鏡檢。分離并純化可疑菌株，采用VITEK-23系統(tǒng)(法國梅里埃生物公司)進行鑒定。藥敏試驗采用ROSCO抗真菌紙片擴散法進行，操作嚴格按照CLSL的標準進行藥敏試驗結(jié)果判斷標準[4]。待檢藥物包括特比萘芬、咪康唑、克霉唑、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素。見表1。

表1 藥敏試驗結(jié)果抑菌圈判斷標準(mm)

注：-表示無數(shù)據(jù)。

1.4 耐藥基因表達水平 采用實時定量-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測耐藥基因表達水平，根據(jù)對咪康唑的耐藥性將菌株分為3組：敏感組、中介組、耐藥組。(1)挑取TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落接種于3 mL的YEPD液體培養(yǎng)基(成都明升生物科技有限公司)中，置于ZHP-100恒溫震蕩培養(yǎng)箱(常州國立研究所)中培養(yǎng)24 h，35 ℃，200 r/min。使用MP RNA快速提取試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)提取總RNA,應(yīng)用OSE-260超微量分光光度計[天根生化科技(北京)有限公司]測量并計算RNA濃度。(2)DNA模板5 μL，PCR緩沖液2 μL，dNTP 2 μL，MgCl22 μL，引物1(upward，上海生物工程公司)0.5 μL，引物2(downward，上海生物工程公司)0.5 μL，dH2O 7.75 μL，Tag 0.25 μL，共20 μL配成反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄條件：94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min，5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增方法：取3 μL反轉(zhuǎn)產(chǎn)物作為模板，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa公司)進行擴增，所有反應(yīng)均同時使用3個復(fù)孔，循環(huán)50次，擴增條件為95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s。內(nèi)參選擇miR-16。溶解曲線Melt curve：65.0～95.0 ℃，increment 0.5 ℃ for 0.05 min+plate read。采用Biorad公司的CFX 962.1實時定量PCR儀進行檢測。Galectin-3的表達量應(yīng)用2-ΔΔCt表示[5]。見表2。

表2 耐藥基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定結(jié)果比較 128例患者中共有84例檢測出假絲酵母菌，4例患者存在2種菌株的重疊感染，共分離出6類假絲酵母菌，共132株。見表3。

表3 假絲酵母菌檢測結(jié)果比較

表4 真菌耐藥性結(jié)果比較[n(%)]

2.2 真菌耐藥性結(jié)果比較 特比萘芬的耐藥率最高，制霉菌素的耐藥率最低、敏感率最高。見表4。

2.3 真菌耐藥基因表達水平比較 3組菌株的MDR1和FLU1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但CDR1的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 真菌耐藥基因表達水平比較

3 討 論

真菌性陰道炎是假絲酵母菌引起的外陰陰道炎性疾病，具有難以根治，容易反復(fù)發(fā)作的特點。目前，臨床抗真菌的有效藥物較少，而致病菌種的變遷及耐藥菌株的出現(xiàn)給真菌性陰道炎的治療造成更大的困難[6]。

本研究128例患者中4例出現(xiàn)重疊感染，共分離出132株菌株，其中84株為白色假絲酵母菌，占63.64%；其次為光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌，分別為14.39%和12.88%。與既往研究相比較，盡管白色假絲酵母菌仍然是真菌性陰道炎最主要的病原菌，但其構(gòu)成比呈下降趨勢[7]；同時，光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌的檢出率增加(均超過10%)。本組部分患者出現(xiàn)克柔假絲酵母菌和清酒假絲酵母菌等罕見菌株感染；4例患者甚至出現(xiàn)2種菌株的合并感染。提示隨著抗菌藥物的大量應(yīng)用，真菌性陰道炎的菌株出現(xiàn)遷移，感染更加復(fù)雜化。

本組對分離菌株的耐藥性分析表明，特比萘芬的耐藥率最高。特比萘芬為廣譜抗真菌藥物，可以選擇性地抑制真菌麥角鯊烯環(huán)氧化酶活性，從而阻斷真菌細胞壁的合成作用；該藥物不影響真菌的細胞色素P450系統(tǒng)[8]。特比萘芬對假絲酵母菌主要發(fā)揮抑菌作用，在真菌性陰道炎的治療中起重要作用[9]。但近些年來，臨床針對耐特比萘芬的假絲酵母菌的報道逐漸增多。本研究假絲酵母菌對特比萘芬的耐藥率高達4.90%，與趙輝等[10]的研究結(jié)果較為相近。

咪康唑的耐藥率居第2位，克霉唑的耐藥率高達6.82%，也應(yīng)該引起臨床重視；同時氟康唑和伊曲康唑也具有一定的耐藥率，提示這4類藥物可能存在交叉耐藥的現(xiàn)象。唑類藥物的作用機制與特比萘芬不同，該類藥物主要作用于真菌的麥角固醇合成酶，通過抑制細胞色素P450系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致羊毛固醇的沉積和麥角固醇的缺乏，影響細胞壁的合成[11]。有研究報道，真菌對唑類藥物的耐藥性主要是由細胞膜藥物外泵蛋白的過度表達引起[12]。本研究中耐藥菌株的MDRI和FLU1表達水平明顯升高，而CDR1表達水平輕度升高。MDR1編碼的mdr1p是異化擴散載體超家族中的1個成員，其可以通過被動擴散的方式將藥物泵出細胞；而FLU1與MDR1具有高度的同源性，作用機制相當(dāng)[13]。CDR1可以編碼ATP結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)運蛋白cdr1p，還可以水解ATP釋放能量而通過主動擴散的方式將藥物泵出[14]。本組盡管唑類藥物均存在耐藥菌株，但大部分菌株對該類藥物較為敏感，故仍具有較高的應(yīng)用價值。同時，由于唑類藥物與特比萘芬通過作用與不同的關(guān)鍵酶而抑制真菌細胞壁的合成，因此，當(dāng)單藥應(yīng)用效果不佳時，可考慮聯(lián)合應(yīng)用。

本研究制霉菌素的耐藥率為0.00%，96.21%的菌株對制霉菌素敏感，故該藥物可以在真菌性陰道炎的治療中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究認為，制霉菌素適用于長期應(yīng)用廣譜抗菌藥物導(dǎo)致的真菌性二重感染，可以用來治療復(fù)雜性的真菌性陰道炎；但該藥物具有一定的肝腎毒性，其臨床應(yīng)用受到一定的限制[15]。

綜上所述，目前真菌性陰道炎的病原菌感染呈現(xiàn)復(fù)雜化趨勢，臨床應(yīng)根據(jù)患者的藥敏試驗選擇抗菌藥物。

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The infection and drug-resistance of Candidas in patients with colpitismycotica

YANGLiu，LIPeng-yu，WANGZhi

(DepartmentofClinicalLaboratories，ArmedPoliceBeijingCorpsHospital，Beijing100027,China)

Objective To analyze the infection and drug-resistance of Candidasin patients with colpitis mycotica.Methods From November 2011 to October 2014,128 patients with colpitismycotica were chosen as study objects.The candidas in vaginal fluid of patients were isolated,and the expression level of MDR1,FLU1 and CDR1 were compared among miconazole-sensitive,miconazole-medium and miconazole-resistant strains.Results In 128 patients,4 patients(3.13%) were infected with two kinds of Candidas,and 132 strains (6 kinds) were isolated and 84 strains (63.64%) were Candida albicans.The resistant rate of terbinafine was 44.70%;the resistant rate of naystatin was 0.00% and its sensitive rate was 96.21%.The expression level of MDR1,FLU1 had statistical difference among miconazole-sensitive,miconazole-medium and miconazole-resistant strains (P<0.05),and that of CDR1 had no statistical difference(P>0.05).Conclusion The infection of Candidas in patients with colpitis has become more complexing，and the use of antifungals should be chosen according to condition of patients.

colpitismycotica; Candidas; drug-resistance

楊柳，女，本科，主管技師，主要從事微生物檢測研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.028

A

1672-9455(2015)12-1730-03

2014-12-22

2015-02-14)