維生素D3 對小鼠肝臟病理學及肝纖維化指標的影響

王家健，蔣紅梅，胡朝暉，黃獻中，谷俊瑩△

(1.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，貴陽 550004；2.廣州金域醫(yī)學檢驗中心，廣州 510330)

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·論 著·

維生素D3 對小鼠肝臟病理學及肝纖維化指標的影響

王家健1，蔣紅梅1，胡朝暉2，黃獻中2，谷俊瑩1△

(1.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，貴陽 550004；2.廣州金域醫(yī)學檢驗中心，廣州 510330)

目的 探討維生素D3 (VitD3)對四氯化碳(CCl4)誘導雌性BALB/C小鼠急性肝損傷(acute liver injury)中肝纖維化指標的影響及其病理學改變。方法 將25只SPF級雌性BALB/C小鼠隨機分為正常對照組、模型組及VitD3高、中、低劑量干預組。VitD3高、中、低劑量組分別每日給予VitD3 15.0 μg、7.5 μg、l.0 μg腹腔注射，正常對照組與模型組腹腔注射等量生理鹽水，預處理2周。VitD3預處理1周后，模型組與VitD3高、中、低劑量組每只小鼠隔日腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液0.2 mL造模，正常對照組與模型組同步隔日腹腔注射生理鹽水，CCl4給藥7 d后，全部小鼠經(jīng)麻醉眼眶采血，分離肝臟并稱質(zhì)量，光鏡下觀察肝組織HE、Masson及網(wǎng)狀纖維染色的病理變化；常規(guī)生化方法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)；放射免疫法檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原N端肽(PⅢNP)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層粘連蛋白(LN)。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組BALB/C小鼠肝臟指數(shù)和血清ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ皆顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，VitD3高、中劑量組的肝臟指數(shù)、ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論 VitD3能有效減輕CCl4誘導急性肝損傷小鼠肝組織的炎性活動度和纖維化程度，提示VitD3具有一定的抗炎、抗纖維化作用。

維生素D3； 肝損傷； 肝纖維化

維生素D3 (VitD3)是一種脂溶性類固醇衍生物，可以維持血液中鈣離子的動態(tài)平衡，促進骨骼礦物化，具有抗佝僂病作用。VitD3在體內(nèi)經(jīng)過肝臟的羥化作用及腎臟活化后，由機體多種組織細胞中廣泛存在的維生素D受體(VDR)介導發(fā)揮作用。近年來有研究表明，VitD3參與細胞的增殖、分化及凋亡,具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等多種生物學功能[1-10]。本研究采用四氯化碳(CCl4) 建立小鼠急性肝損傷模型，同時給予VitD3預處理，探討VitD3對急性肝損傷中病理學特征及血清肝纖維化指標的影響。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/C小鼠25只，雌性，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級，周齡為5～6周。由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號：No.44007200010966。

1.2 儀器與試劑 GC-2016γ放射免疫計數(shù)器，安徽中科中佳科學儀器有限公司。DL-45RC-L低速冷凍大容量離心機。光學顯微鏡，奧林巴斯。BSA223S分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。CCl4，廣東光華科技股份有限公司，批號20131230。VitD3注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號12118。橄欖油，透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原N端肽(PⅢNP)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層粘連蛋白(LN)放射免疫試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，羅氏ModularP+ISE900系統(tǒng)檢測。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 BALB/C小鼠飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h光照和黑夜循環(huán),普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，經(jīng)免疫觀察1周，適應新環(huán)境后，隨機分為5組，分別為正常對照組(A)5只，模型組(B)5只，VitD3低劑量組(C)、VitD3中劑量組(D)、VitD3高劑量組(E)各5只。

1.3.2 實驗方法 動物實驗方法參照文獻[10]加以改進。CCl4使用橄欖油稀釋至0.1%備用。VitD3溶解于無菌醫(yī)用生理鹽水，分別稀釋至低、中、高劑量(1.0 μg、7.5 μg、15.0 μg)。低、中、高劑量組分別腹腔注射1.0 μg、7.5 μg、15.0 μg VitD3(0.2 mL，ip)，每天1次，正常對照組和模型組每日腹腔注射等劑量的生理鹽水，預處理1周后，分別給予模型組、VitD3(低、中、高劑量)組隔日腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液(0.2 mL，ip)制造實驗性肝損傷模型，正常對照組隔日給予同等量的生理鹽水，同時也每日給VitD3低、中、高劑量組分別腹腔注射VitD3(1.0 μg、7.5 μg、15.0 μg)。VitD3給予2周后全部小鼠禁食不禁水15 h后稱質(zhì)量，在10%水合氯醛麻醉下眼眶采取全部血液，3 000 r/min，離心5 min，分離血清置于冰箱保存；獲取肝臟，觀察其形態(tài)并稱質(zhì)量，取一小部分肝組織浸入福爾馬林固定，制作病理切片，分別進行HE、Masson及網(wǎng)狀纖維染色。見表1。

表1 動物實驗方法

注：-表示無數(shù)據(jù)。

1.4 肝臟指數(shù)計算 肝臟指數(shù)(%)=肝臟濕質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

1.5 病理形態(tài)學觀察 肝組織病理切片分別進行HE染色、Masson染色及膠原纖維染色，肝組織的炎性活動度和纖維化程度采用METAVIR系統(tǒng)評價。

2 結(jié) 果

2.1 VitD3對5組BALB/C小鼠肝功能指標的影響 模型組BALB/C小鼠血清ALT、AST與正常對照組比較，均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。VitD3高劑量組和中劑量組小鼠血清ALT、AST均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。VitD3高劑量組BALB/C小鼠血清ALT、AST顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AST/ALT水平各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2 VitD3對5組BALB/C小鼠肝纖維化的影響 模型組BALB/C小鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ與正常對照組比較，均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。VitD3高劑量組和中劑量組小鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CG均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。VitD3高劑量組BALB/C小鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。VitD3中劑量組BALB/C小鼠血清HA、PⅢNP顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表2 VitD3對5組BALB/C小鼠肝功能指標的影響

2.3 5組BALB/C小鼠病理形態(tài)變化

2.3.1 實驗動物一般情況 整個給藥過程中，各組小鼠活潑，活動自如，毛發(fā)整齊、有光澤，攝食量、體質(zhì)量未見異常。給予CCl4造模后，除正常對照組外，其余各組均出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量明顯減輕，反應遲緩，少動，嗆毛，毛發(fā)出現(xiàn)蓬亂、無光澤等。

2.3.2 肝臟肉眼觀察 A組小鼠肝臟紅褐色，表面光滑，質(zhì)軟顏色正常。模型組小鼠肝臟明顯腫大，色蒼黃、呈結(jié)節(jié)狀，油膩，質(zhì)硬。經(jīng)VitD3預處理的各劑量組雖也呈現(xiàn)不同程度的腫大，但表面稍微光滑，質(zhì)地呈不同程度較韌，顏色偏黃。

表3 VitD3對5組BALB/C小鼠血清肝纖維化指標的影響

2.3.3 臟器系數(shù)結(jié)果分析 模型組BALB/C小鼠肝臟指數(shù)顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 0)。VitD3高、中、低劑量組的肝臟指數(shù)與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005 2，P=0.001 9,P=0.000 0)。

2.3.4 各組BALB/C小鼠肝組織HE、Masson、網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果 正常組HE染色肝小葉及匯管區(qū)未見異常；Masson和網(wǎng)狀纖維染色未見纖維化。模型組肝小葉及匯管區(qū)見大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，肝細胞出現(xiàn)嚴重的脂肪變性，部分肝細胞腫大，胞質(zhì)呈氣球樣變(泡沫樣細胞)，片狀壞死區(qū)域；匯管區(qū)周圍纖維化明顯,有芒狀纖維和纖維間隔形成,可見網(wǎng)狀纖維支架塌陷。低劑量組肝小葉及匯管區(qū)可見中性粒細胞、泡沫樣細胞、淋巴細胞浸潤，點狀壞死；匯管區(qū)周圍纖維化,纖維間隔形成。中劑量組肝小葉可見少量泡沫樣細胞，匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤，點狀壞死區(qū)域；少量纖維化。高劑量組肝小葉基本正常，泡沫細胞明顯減少，淋巴基本浸潤，纖維組織未見增生，未見壞死區(qū)域；纖維化程度明顯減輕。肝組織的炎性活動度和纖維化程度經(jīng)METAVIR系統(tǒng)評價后，炎性活動度評分：A組=0，B組=3.0，C組=3.0，D組=2.0，E組=1.6。纖維化程度評分：A組=0，B組=3.0，C組=3.0，D組=2.0，E組=1.0)：與正常對照組比較，模型組的炎性活動度和纖維化評分均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，VitD3高、中劑量組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

Ⅰ為正常對照組；Ⅱ為模型組；Ⅲ為VitD3低劑量組；Ⅳ為VitD3中劑量組；Ⅴ為VitD3高劑量組。

圖1 各組小鼠肝組織染色結(jié)果(×100)

3 討 論

CCl4誘導的急性化學性肝損傷的動物模型廣泛用于肝細胞保護藥物的研究中，脂質(zhì)過氧化是CCl4造成肝損傷的主要機制。CCl4進入機體后，經(jīng)肝臟細胞色素P450激活，形成CCl3·，其能與細胞膜上的不飽和脂肪酸反應生成脂肪酸原子團，從而引起脂質(zhì)氧化而導致細胞膜、細胞器損傷，繼而出現(xiàn)屏障紊亂，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲出,導致血清ALT和AST含量升高(如肝臟炎性損傷時),ALT活性顯著升高提示細胞膜損傷。本研究模型組BALB/C小鼠肝臟指數(shù)和血清ALT、HA、LN、PⅢNP、CⅣ均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組BALB/C小鼠肝組織HE染色顯示，肝小葉及匯管區(qū)見大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，肝細胞出現(xiàn)嚴重的脂肪變性，部分肝細胞腫大，胞質(zhì)呈氣球樣變(泡沫樣細胞)，片狀壞死區(qū)域；Masson和網(wǎng)狀纖維染色提示，匯管區(qū)周圍纖維化明顯,有芒狀纖維和纖維間隔形成,可見網(wǎng)狀纖維支架塌陷，表明 CCl4所致肝損傷模型復制成功。

肝細胞受到肝炎病毒、乙醇、化學毒物等各種因素引起急性肝損傷后，肝細胞會發(fā)生變性、壞死，還可進一步發(fā)展成肝纖維化。因此，改善或逆轉(zhuǎn)肝纖維化程度對防治肝硬化及肝癌具有臨床價值。相關(guān)研究結(jié)果顯示，肝硬化患者普遍存在維生素D 不足或缺乏，慢性乙型肝炎患者若血清維生素 D 水平大于50 μmol/L則能減緩肝纖維化進程[11]。近年來的研究表明，維生素D與各種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性[2-5]，在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤方面均有不同程度的改善[12-13]。Abramovitch等[13]研究報道，維生素D可抑制肝星狀細胞增殖和肝纖維化。本組HE染色肝組織的活動度和纖維化程度的評分也顯示VitD3預處理高劑量組和中劑量組的預防效果均顯著，表明VitD3對小鼠急性肝損傷有保護作用，且不同劑量之間也有一定差異，說明VitD3對其保護作用有劑量大小依賴性。本研究給予不同劑量VitD3的預處理組的肝臟指數(shù)、肝功能指標(ALT、AST)和肝纖維化指標(HA、LN、PⅢNP、CⅣ)比模型組均顯著改善，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；肝組織病理學觀察也表明高劑量與中劑量VitD3能明顯減輕肝臟的病理損傷,顯著減輕小鼠肝細胞變性壞死和炎性細胞浸潤,網(wǎng)狀纖維明顯減少。提示VitD3實驗性肝損傷具有一定抗炎作用和早期抗纖維化,并能有效降低血清纖維化指標。

致謝：感謝朱慶義教授在論文寫作中給予了許多指導與建議，感謝廣州金域醫(yī)學檢驗中心王春霞博士、黃獻中老師、徐煒老師在論文選題、實驗操作的指導。

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Effects of vitamin D3 on liver pathology and fibrotic profiles of mice experimental hepatic injury

WANGJia-jian1，JIANGHong-mei1，HUChao-hui2，HUANGXian-zhong2,GUJun-ying1△

(1.DepartmentofLaboratory，GuiyangMedicalCollege，Guiyang,Guizhou550004，China;2.GuangzhouKingmedCenterforClinicalLaboratory,Guangzhou,Guangdong510330,China)

Objective To investigate the effects of vitamin D3 on liver pathology and fibrotic profiles,acute liver injury was produced in BALB/C mice by CCl4.Methods Twenty five BALB/C mice were randomly and equally divided into five groups:control group,vehicle group,and three vitamin D3 groups (n=5 for each group).Doses of vitamin D3 were 15 μg，7.5 μg，1 μg in the vitamin D3 groups (daily,intraperitoneal),which were indicated as high,medium and low does.Mice in control group and vehicle group were daily intraperitoneal injected with 0.9%Nacl.After the two weeks treatment,vehicle group and treatment groups were intraperitoneal injected with 0.1%CCl4in olive (0.2 mL/2 d,ip) 7 days later.Meanwhile,the control group was equivalently intraperitoneal injected with 0.9%Nacl daily.At the end of administration of CCl4solution,blood and liver tissue were harvested from all the mice.Pathological changes in liver tissues were analyzed by HE staining,reticular fiber staining and Masson staining.Alanine aminotransferase (ALT) and Aspartate transaminase (AST) were detected with routine biochemical method.Hyauline (HA),collagen typeⅣ (IVC),laminin(LN),and collagen typeⅢN-terminal peptide (PⅢNP) were detected with RIA.Results The levels of liver index,ALT,AST,HA,LN,PⅢNP,CⅣ were significantly higher in the vehicle group than that in the control group (allP<0.01).Compared with vehicle group,the levels of serum liver index,ALT,AST,HA,LN,PⅢNP,CⅣ were significantly debased after the treatment with vitamin D3 (allP<0.01).Conclusion Vitamin D3 has anti-inflammation and anti-fibrosis effects in the mice experimental liver injuries induced by CCl4,by reducing level of serum fibrosis in early liver fibrosis.

vitamin D3; experimental hepatic injury; liver fibrosis

王家健，男，碩士，檢驗師，主要從事免疫學研究?！?/p>

，E-mail：921469044@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.020

A

1672-9455(2015)12-1710-03

2014-12-25

2015-02-15)