HK型α珠蛋白生成障礙基因診斷及其家系分析

姚亞超，李 磊，李澤泳，李亞紅，李 楠，張 珍，嚴(yán) 芳，張 智△

(1.廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510317；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510150)

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·論 著·

HK型α珠蛋白生成障礙基因診斷及其家系分析

姚亞超1，李 磊2，李澤泳1，李亞紅1，李 楠1，張 珍1，嚴(yán) 芳1，張 智1△

(1.廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510317；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510150)

目的 建立HK型α珠蛋白生成障礙基因的分子診斷方法，為臨床產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供指導(dǎo)。方法 單管多重Gap-PCR的方法檢測(cè)3種常見(jiàn)α缺失型珠蛋白生成障礙，PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù)檢測(cè)αCS、αQS、αWS3種α非缺失型珠蛋白生成障礙，巢式PCR檢測(cè)HKαα型α珠蛋白生成障礙。總結(jié)HKαα型α珠蛋白生成障礙基因型及臨床表型。比較HKαα型胎兒基因變異與家系關(guān)系。結(jié)果 在8 000例疑似α珠蛋白生成障礙患者中，HKαα型α珠蛋白生成障礙患者27例且存在3個(gè)HKαα家系，發(fā)現(xiàn)1例罕見(jiàn)的αQS和HKαα的混合雜合子(αQSα/HKαα)。結(jié)論 巢式PCR可檢測(cè)HKαα型α珠蛋白生成障礙，用于育齡夫婦的基因診斷和高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的產(chǎn)前診斷。

α珠蛋白生成障礙； 產(chǎn)前診斷； 系譜； HKαα

α珠蛋白生成障礙是一種世界范圍的遺傳性血液病，主要發(fā)生在東南亞和中國(guó)的熱帶和亞熱帶區(qū)域[1]。我國(guó)廣西的α珠蛋白生成障礙攜帶率為17.55%,廣東為8.53%[2]。α珠蛋白生成障礙是α珠蛋白基因簇的缺失或者非缺失突變而引起的小細(xì)胞低色素性貧血，α珠蛋白基因簇的順序?yàn)椋?′-ζ2-Ψζ1-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ-3′。α2和α1珠蛋白基因高度同源，包含3段同源性序列(X、Y、Z同源盒)；這3個(gè)同源盒由非同源區(qū)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)截?cái)喔糸_[3]。

在我國(guó)南方珠蛋白生成障礙流行地區(qū)，--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα是最常見(jiàn)的幾種α珠蛋白生成障礙的缺失類型[2,4-5]。其他種類的α珠蛋白生成障礙，如--11.1/αα、-α27.6/αα、α珠蛋白基因多聯(lián)體(αααanti3.7和αααanti4.2)也被檢測(cè)出[6-8]。α珠蛋白基因的缺失或者增多是同源性或者非同源性重組的結(jié)果，常見(jiàn)α2和α1珠蛋白基因之間不平等交換可產(chǎn)生單個(gè)α珠蛋白基因的缺失(-α3.7和-α4.2)，以及對(duì)側(cè)重復(fù)的三聯(lián)體基因(αααanti3.7和αααanti4.2),這些突變均可通過(guò)Gap-PCR的方法檢測(cè)[9]。此外，在α珠蛋白基因簇區(qū)域有更為復(fù)雜的交換，可產(chǎn)生四聯(lián)體基因αααα、成組出現(xiàn)的α2和α1珠蛋白基因(α212和α121)、HKαα基因[10-15]。HKαα基因是-α3.7和αααanti4.2不等位交換形成，僅有極少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]。本研究擬建立一種檢測(cè)HKαα的方法，通過(guò)產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)1例罕見(jiàn)αQS和HKαα的混合雜合子(αQSα/HKαα)，現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)行其家系分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年12月至2014年8月廣東省第二人民醫(yī)院8 000例疑似α珠蛋白生成障礙患者的孕前咨詢夫婦、孕婦的資料。記錄受檢者姓名、性別、年齡等信息，血紅蛋白(Hb)電泳、血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果資料和基因診斷結(jié)果，由廣東省第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室匯總后輸入Excel軟件數(shù)據(jù)庫(kù)中保存。

1.2 樣本采集 采集受檢者外周血3 mL，乙二胺四乙酸抗凝；胎兒標(biāo)本均為羊水，每例分3管共抽取羊水10 mL。按磁珠法提取外周血標(biāo)本的基因組DNA，羊水標(biāo)本采用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)由雙人獨(dú)立提取雙份產(chǎn)前標(biāo)本DNA。

1.3 血液學(xué)表型分析 采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(X-2100，日本Sysmex公司)進(jìn)行紅細(xì)參數(shù)分析；使用快速自動(dòng)電泳分析系統(tǒng)(法國(guó)Sebia公司)進(jìn)行Hb電泳及Hb組分定量檢測(cè)。

1.4 基因型分析 α珠蛋白生成障礙的分子診斷采用單管多重跨越斷裂位點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)(Gap-PCR)技術(shù)檢測(cè)3種常見(jiàn)α缺失型珠蛋白生成障礙；相關(guān)引物參照文獻(xiàn)[16]，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。采用Takara公司生產(chǎn)的LA酶配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性 96 ℃ 5 mim；先進(jìn)行10個(gè)循環(huán)：98 ℃ 45 s，62 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 3 min；再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)：98 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min；最后延伸 72 ℃ 10 min。見(jiàn)表1。PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交(RDB)技術(shù)檢測(cè)αCS、αQS、和αWS3種α非缺失型珠蛋白生成障礙。常規(guī)電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的特殊條帶標(biāo)本，采用巢式PCR檢測(cè)出HK αα型珠蛋白生成障礙。Gap-PCR檢測(cè)常規(guī)α缺失后，擴(kuò)增結(jié)果顯示-α3.7和α2基因，且-α3.7電泳條帶非常細(xì)弱，α2基因條帶濃粗時(shí)，經(jīng)過(guò)2次電泳證實(shí)此現(xiàn)象，疑為HKαα基因存在。電泳結(jié)果顯示為-α3.7、α2基因、--SEA3個(gè)條帶時(shí)，同樣考慮HKαα基因存在，對(duì)可疑樣本再進(jìn)行HKαα檢測(cè)。采用Takara公司生產(chǎn)的LA酶配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 mim；35個(gè)循環(huán)：97 ℃ 1 min，60 ℃ 2 min，72 ℃ 4 min；最后延伸 72 ℃ 10 min。將巢式PCR第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1 000倍后，作為第2輪擴(kuò)增的模板，采用Takara公司生產(chǎn)的LA酶配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 5mim；35個(gè)循環(huán)：97 ℃ 1 min，60 ℃ 2 min，72 ℃ 4 min；最后延伸 72 ℃ 10 min。使用針對(duì)部分Z2+和Z1同源盒的引物(a2/3.7-F和3.7-R)來(lái)擴(kuò)增HK αα基因；基因型為αα/αα和-α3.7/αα的標(biāo)本在1.9 Kb位置處無(wú)相應(yīng)條帶的出現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HK型α地中海貧血基因的分子診斷結(jié)果 Gap-PCR檢測(cè)常規(guī)α缺失后，擴(kuò)增結(jié)果顯示-α3.7和α2基因，且-α3.7電泳條帶非常細(xì)弱，α2基因條帶濃粗時(shí)，經(jīng)過(guò)2次電泳證實(shí)此現(xiàn)象，疑為HKαα基因存在。電泳結(jié)果顯示為-α3.7、α2基因、--SEA3個(gè)條帶時(shí)同樣考慮HKαα基因的存在。選擇可疑標(biāo)本2號(hào)和4號(hào)進(jìn)行HK基因的驗(yàn)證。電泳結(jié)果顯示各個(gè)組均擴(kuò)增出α1基因位置處的同源盒序列。將第1輪的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1 000倍后作為第2輪擴(kuò)增的模板，使用針對(duì)部分Z2+和Z1同源盒的引物a2/3.7-F和3.7-R來(lái)擴(kuò)增HKαα基因，基因型為αα/αα和-α3.7/αα的標(biāo)本在1.9Kb位置處無(wú)相應(yīng)條帶的出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

2.2 基因診斷及血液學(xué)分析結(jié)果 8 000例基因分析確診的珠蛋白生成障礙患者中，HKαα型α珠蛋白生成障礙患者27例。27例HKαα型α珠蛋白生成障礙患者中，檢出HKαα/αα 19例、--SEA/HKαα 7例、αQSα/HKαα 1例；27例HKαα型α珠蛋白生成障礙患者存在3例HKαα家系。血液學(xué)分析結(jié)果顯示，HKαα/αα的血常規(guī)結(jié)果表現(xiàn)正常；--SEA/HKαα患者的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為小細(xì)胞、低色素，但貧血癥狀較輕或無(wú)貧血。臨床癥狀較--SEA/αα嚴(yán)重，但沒(méi)有達(dá)到--SEA/-α3.7的嚴(yán)重程度[17]。見(jiàn)表2。

注：A圖為單管多重Gap-PCR方法檢測(cè)3種常見(jiàn)α缺失型珠蛋白生成障礙；1：-α3.7/αα；2：HKαα/αα；3：--SEA/-α3.7；4：--SEA/HKαα；5：正常對(duì)照；6：空白對(duì)照；7：SEA對(duì)照。B圖為第1輪PCR。C圖為巢式PCR檢測(cè)-α3.7條帶。

圖1 巢式PCR檢測(cè)HK αα片段電泳圖

表2 不同類型的α珠蛋白生成障礙患者的血液學(xué)資料分析

表3 3個(gè)HK型地中海貧血家系的血液學(xué)表型分析結(jié)果

2.3 產(chǎn)前診斷結(jié)果 產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)3個(gè)家系胎兒雜合子3例，其中1例為HKαα/αα；1例為αQSα/HKαα；另外1例為--SEA/HKαα。見(jiàn)表3、4。

表4 3個(gè)HK型地中海貧血家系基因診斷及產(chǎn)前診斷結(jié)果

3 討 論

缺失型α珠蛋白生成障礙是α珠蛋白基因的1條或2條因同源性或非同源性重組而丟失。非平衡交叉連接會(huì)產(chǎn)生多種復(fù)雜的缺失基因型，其中HKαα是一種極少見(jiàn)的非平衡交叉連接，表現(xiàn)為在同一條染色體上同時(shí)含有-α3.7缺失及αααanti4.2基因的交叉連接片段[14]。

基因型為HKαα/αα的患者易被診斷為-α3.7/αα，并且與健康者比較，HKαα/αα患者的α球蛋白mRNA水平無(wú)明顯差異[18]。本研究統(tǒng)計(jì)分析不同類型的α珠蛋白生成障礙患者的血液學(xué)資料，結(jié)果顯示HKαα/αα的臨床癥狀較-α3.7/αα輕很多；基因型為--SEA/HKαα的患者不表現(xiàn)為Hb H，僅表現(xiàn)為輕度珠蛋白生成障礙，Hb>100 g/L，與相關(guān)學(xué)者的報(bào)道一致[18-19]。而基因型為--SEA/-α3.7的患者由于缺失了3個(gè)α珠蛋白基因，臨床上表現(xiàn)為Hb H疾病，Hb<100 g/L。

本研究8 000例疑似α珠蛋白生成障礙患者中，HKαα型α珠蛋白生成障礙患者27例，陽(yáng)性率約為0.34%，與廣西地區(qū)HK αα的攜帶率(0.07%)有較大的差異[18,20]，分析原因主要為標(biāo)本選擇不同，本研究對(duì)象為篩查結(jié)果中疑似α珠蛋白生成障礙的患者，本組Hb A2的參考值為3.0%～3.5%，靜止型珠蛋白生成障礙臨床癥狀輕微者可在篩查實(shí)驗(yàn)中檢出，從而得出較高的HKαα陽(yáng)性率。對(duì)于HKαα型α珠蛋白生成障礙的較高的攜帶率，常規(guī)Gap-PCR檢測(cè)技術(shù)易將-α3.7誤診為HKαα，但HKαα型珠蛋白生成障礙的臨床表現(xiàn)不同于常見(jiàn)的α珠蛋白生成障礙，容易誤將輕度診斷為中重度，因此HKαα型α珠蛋白生成障礙的分子診斷和產(chǎn)前診斷十分重要。

本研究根據(jù)HKαα的發(fā)生機(jī)制，即存在不同同源盒部位的基因重組[14,18]，采用巢式PCR方法檢測(cè)HK型珠蛋白生成障礙，為后續(xù)基因診斷和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。本組證實(shí)HKαα基因的存在，但是HKαα的發(fā)生機(jī)制比較特殊，不能排除另外一條染色體合并-α3.7缺失的可能，患者確切的基因型需要進(jìn)行家系分析。本研究表明產(chǎn)前診斷家系2的胎兒存在HKαα的同時(shí)，合并αQS點(diǎn)突變。與以往的報(bào)道[14-15,21]相比，αQSα/HKαα為首次發(fā)現(xiàn)的基因型，可將HKαα的檢測(cè)應(yīng)用到產(chǎn)前診斷。

本研究對(duì)產(chǎn)前診斷保健的孕婦及其配偶都進(jìn)行血液學(xué)表型篩查：血常規(guī)、Hb含量分析，對(duì)疑為α珠蛋白生成障礙表型陽(yáng)性的患者，排除缺鐵性貧血的情況下(如平均紅細(xì)胞容積小于80 fL和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量小于27 pg，Hb<3.0%者)，按常規(guī)Gap-PCR技術(shù)檢測(cè)--SEA、-α3.7、-α4.2，若為陽(yáng)性，則其配偶也需做相同基因分析。本組3個(gè)HK家系因夫妻雙方均為α珠蛋白生成障礙基因攜帶者，根據(jù)遺傳規(guī)律將會(huì)生育中重度珠蛋白生成障礙患兒，其出生會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，故育齡夫婦需開展HK型珠蛋白生成障礙表型篩查和基因診斷，同時(shí)為曾生育中重度珠蛋白生成障礙患者或者為中重度珠蛋白生成障礙風(fēng)險(xiǎn)胎兒的家庭進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

本研究采用HKαα型珠蛋白生成障礙的分子診斷方法，成功地進(jìn)行了3個(gè)HKαα家系的產(chǎn)前診斷。應(yīng)用HKαα珠蛋白生成障礙的表型篩查和基因診斷技術(shù)，有助于我國(guó)α珠蛋白生成障礙高發(fā)區(qū)產(chǎn)前診斷水平的進(jìn)一步提高。

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Molecular diagnosis and pedigree analyzation of HKαα thalassemia*

YAOYa-chao1,LILei2,LIZe-yong1,LIYa-hong1,LiNan1,ZHANGZhen1,YANFang1,ZHANGZhi1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,theSecondPeople′sHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou,Guangdong510317,China；2.DepartmentofReproductiveMedicineCenter,KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China)

Objective To establish a method for detection the genotype of HK in α-thalassemia and to provide a precise pregnant diagnosis and an effective genetic counseling for thalassemia (thal)．Methods The single tube complex PCR was used to detect 3 types of deletional α-thal．Reverse dot blotting(RDB)/PCR to detect 3 kinds of undeletional α-thal--αCS,αQSand αWSwhich were common in Chinese population．The method of two-round nested PCR assay is successfully established to detect the genotype of HK in α-thal.Then we collect the clinical data of the patients with the genotype of HK in α-thal and analyse the association between the genotype and hematological phenotype.Further,we analyse the relationship between fetal genotype variation and the pedigree.Results A total of 8 000 cases from Guangdong were undergone thal genotype genetic diagnosis．Among the 8 000 cases，27 cases were diagnosed as the genotype of HK in α-thal，including 3 pedigrees.We report the pregnant diagnosis results for which the parents had the same type of genotype.Moreover,the hematological phenotype data were collected.Conclusion The two-round nested PCR method could effectively detect the HK genotype in α-thal.Through careful molecular tests,one case of prenatal heterozygosity of αQSα/HKαα was identified，and the fetus is kept successfully through careful clinical counseling．

alpha-thalassemia； prenatal diagnosis； pedigree

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81400639)；廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2014C39)。

姚亞超，女，博士，主管技師，主要從事分子生物學(xué)研究。

△通訊作者，E-mail：yalw135@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.006

A

1672-9455(2015)12-1672-04

2014-12-20

2015-02-15)