熒光原位雜交技術(shù)在先天性心臟病產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

趙 婧,黃 湘,李紅艷,梁少霞

(廣東省中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心 528400)

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·論 著·

熒光原位雜交技術(shù)在先天性心臟病產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

趙 婧,黃 湘,李紅艷,梁少霞

(廣東省中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心 528400)

目的 探討采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢查法對(duì)先天性心臟病胎兒進(jìn)行染色體22q11微缺失產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用。方法 應(yīng)用常規(guī)染色體核型分析及FISH檢查法，對(duì)2012年3月至2014年10月中山市博愛醫(yī)院收治的52例疑似妊娠22q11微缺失胎兒的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前22q11微缺失檢查并跟蹤隨訪。結(jié)果 所有胎兒染色體核型分析均無異常，F(xiàn)ISH檢查結(jié)果顯示3例呈陽性。結(jié)論 染色體核型分析無法檢測(cè)22q11微缺失綜合征，因此對(duì)有22q11微缺失先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)的胎兒產(chǎn)前診斷應(yīng)用FISH檢查法，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

22q11微缺失;熒光原位雜交技術(shù);先天性心臟病;產(chǎn)前診斷

先天性心臟病(CHD)是一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病，其病因復(fù)雜，治療困難。我國(guó)每年大約有(10～15)萬CHD患兒出生，患兒家庭和社會(huì)都承擔(dān)著巨大的負(fù)擔(dān)。CHD主要是指胎兒在胚胎發(fā)育期心臟及周圍血管組織發(fā)育異常造成的胎兒出生后心臟、血管功能結(jié)構(gòu)的異常，是最常見的一種胎兒畸形，也是我國(guó)生育監(jiān)測(cè)的主要病種之一[1]。新生兒CHD患病率為0.8%～1.0%，因?yàn)镃HD治療困難、新生兒手術(shù)的復(fù)雜和危險(xiǎn)，使CHD病死率極高。有統(tǒng)計(jì)顯示，死胎死產(chǎn)中有1/5是患有嚴(yán)重CHD的胎兒，而因先天性缺陷夭折的新生兒中嚴(yán)重CHD患兒占1/3，兒童期死亡患兒超過半數(shù)是CHD患兒[2]。作為一種先天畸形疾病，CHD的發(fā)病原因復(fù)雜，目前研究主要與遺傳、環(huán)境、遺傳-環(huán)境因素共同作用有關(guān)[3]。遺傳因素主要體現(xiàn)為染色體異常，而22q11微缺失綜合征是最常見的一種染色體異常，是比較常見的CHD病因。研究報(bào)道最多的心臟畸形，國(guó)內(nèi)比例為74%，美國(guó)該比例達(dá)85%，一般是圓錐動(dòng)脈干呈現(xiàn)畸形，表現(xiàn)為法洛四聯(lián)征、主動(dòng)脈中斷、肺動(dòng)脈閉鎖、室間隔缺損等，前二者疾病的預(yù)后極差[4]。對(duì)于22q11微缺失的檢查，由于該缺失片段大小在1.5～3.0 Mb，是比進(jìn)行染色體核型分析時(shí)的分辨下限5.0 Mb還小的片段，因此通過常規(guī)的染色體核型分析產(chǎn)前診斷法無法檢測(cè)出該疾病，需要引入分辨率更高的技術(shù)手段。本研究采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢查法對(duì)22q11微缺失CHD胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，F(xiàn)ISH檢查法是將經(jīng)熒光標(biāo)記的特異性探針與相關(guān)染色體中DNA序列雜交，再通過熒光顯微鏡觀察待檢染色體是否存在某些片段的缺失[5]。該方法快速、準(zhǔn)確、敏感性高、特異性強(qiáng)，是進(jìn)行22q11微缺失檢查的首選技術(shù)。本研究即對(duì)使用FISH檢查法的22q11微缺失CHD胎兒的產(chǎn)前檢查的臨床應(yīng)用進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3月至2014年10月本院收治的52例似妊娠22q11微缺失胎兒的孕期婦女作為研究對(duì)象，所有產(chǎn)婦的胎兒胎齡3～8個(gè)月不等，孕婦年齡23～35歲，平均28.4歲。研究對(duì)象包括24例曾生產(chǎn)或引產(chǎn)過一個(gè)CHD或面部畸形胎兒的孕婦，本次妊娠的彩色多普勒超聲檢測(cè)中未顯示心臟畸形或面部畸形；23例產(chǎn)前彩色多普勒超聲檢測(cè)顯示胎兒有心臟畸形[6]；5例超聲檢測(cè)懷疑胎兒有唇、腭裂。進(jìn)一步研究前，所有病例及其家屬均知曉研究?jī)?nèi)容，簽署知情同意書，此研究獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 進(jìn)行羊水細(xì)胞的常規(guī)染色體核型分析及FISH檢查[7]。

1.2.1 羊水細(xì)胞獲得 施行羊膜腔穿刺術(shù)以獲得適量羊水細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)室的染色體核型分析及FISH檢查。采集羊水細(xì)胞前，產(chǎn)婦排凈膀胱、仰臥位；事前經(jīng)超聲檢查確定胎盤位置、羊水深度，便于穿刺部位的選擇；穿刺時(shí)一手固定穿刺部位，一手準(zhǔn)確將穿刺針垂直刺入宮腔，拔除針芯，見有清亮的淡黃色羊水溢出，使用注射器抽取10 mL羊水后再插入針芯、拔除穿刺針。將羊水存入無菌試管，送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)以進(jìn)行下一步檢查；對(duì)產(chǎn)婦穿刺部位進(jìn)行無菌敷料處理，觀察半小時(shí)如無異常，告知相關(guān)注意事項(xiàng)后即可離開。

1.2.2 常規(guī)染色體核型分析 22q11微缺失綜合征除了微片段缺失外，可能還伴有染色體異位，數(shù)目、形態(tài)異常(環(huán)形)等畸變。因此在進(jìn)行FISH檢查前常需通過常規(guī)染色體核型分析以排除可能的畸變。將所采集的羊水裝于離心管中進(jìn)行細(xì)胞接種培養(yǎng)；獲得的細(xì)胞經(jīng)固定、滴片、烤片制成標(biāo)本，將染色體標(biāo)本片放入所制備的胰蛋白酶溶液中，振搖2、3 min用生理鹽水漂洗，經(jīng)染色劑染色、沖洗、曬干后進(jìn)行鏡檢，查看染色體帶紋顯現(xiàn)(顯帶)效果，可多做幾次取得最滿意效果；選擇鏡檢中分散效果較好的核型為圖像采集對(duì)象。

1.2.3 FISH檢查 將染色體核型分析余下的細(xì)胞懸液制成標(biāo)本片備用。以北京金菩嘉公司的雙色熒光22q11探針和相應(yīng)試劑盒為檢測(cè)工具，探針與變性后標(biāo)本片的雜交結(jié)合位點(diǎn)為TUPLE1：22q11；ARSA：22q13。二者的熒光信號(hào)分別為紅色和綠色，是彼此的內(nèi)對(duì)照探針，而TUPLE1與ARSA互為內(nèi)對(duì)照基因。以熒光顯微鏡記錄最終結(jié)果，通過FISH圖像分析處理系統(tǒng)采集染色體核型與熒光信號(hào)。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) FISH檢查后進(jìn)行鏡檢，隨機(jī)選擇100個(gè)左右中期分裂狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行觀察，細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光標(biāo)記的是22號(hào)染色體，若22號(hào)染色體上還可見2個(gè)紅色熒光信號(hào)，說明22q11無缺失；若只見一個(gè)紅色熒光信號(hào)，說明存在22q11微缺失。因此，判定結(jié)果為：若90%以上細(xì)胞內(nèi)各有2個(gè)紅、綠熒光信號(hào)(圖1)，可判定為FISH檢查呈陰性，胎兒不存在22q11缺失；若有60%分裂狀態(tài)細(xì)胞出現(xiàn)1個(gè)紅色熒光信號(hào)、2個(gè)綠色熒光信號(hào)(圖2)，可判定FISH檢查呈陽性，胎兒存在22q11微缺失。

圖1 FISH檢查陰性結(jié)果

圖2 FISH檢查陽性結(jié)果

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)染色體核型分析結(jié)果 對(duì)所有產(chǎn)婦的羊水細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色體核型分析后顯示未檢測(cè)到染色體微缺失、核型分析均無異常，可排除可能存在的染色體異位、數(shù)目異常等染色體畸變。

2.2 FISH檢查結(jié)果 24例曾生產(chǎn)或引產(chǎn)過一個(gè)CHD或面部畸形胎兒的孕婦，本次妊娠的彩色多普勒超聲檢測(cè)中未顯示異常；FISH檢查結(jié)果顯示超過90%細(xì)胞內(nèi)有2個(gè)紅2個(gè)綠熒光信號(hào)，說明不存在22q11微缺失。23例產(chǎn)前彩色多普勒超聲檢測(cè)顯示胎兒有心臟畸形的孕婦，施行FISH檢查的產(chǎn)前診斷，結(jié)果顯示，20例患者有90%細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)2個(gè)紅2個(gè)綠熒光信號(hào)，說明不存在22q11微缺失，另3例有60%以上細(xì)胞呈現(xiàn)1紅2個(gè)綠熒光信號(hào)，說明存在22q11微缺失；5例超聲檢測(cè)懷疑胎兒有唇、腭裂的病例產(chǎn)前診斷FISH檢測(cè)結(jié)果顯示有2個(gè)紅2個(gè)綠熒光信號(hào)，不存在22q11微缺失。得出FISH檢查結(jié)果后，對(duì)于證實(shí)有22q11微缺失的陽性患者，孕婦及其家屬同意進(jìn)行引產(chǎn)手術(shù)，而其他患者出于個(gè)人考慮作出了活產(chǎn)與引產(chǎn)的決定，詳細(xì)檢查和隨訪結(jié)果見表1。

表1 52例孕婦產(chǎn)前FISH檢查及隨訪結(jié)果表(n)

3 討 論

CHD是導(dǎo)致新生兒缺陷或死亡的主要原因，病因復(fù)雜。目前少數(shù)確證的病因之一認(rèn)為它是一種多基因遺傳病，是22q11微缺失綜合征的主要表型[8-9]。CHD治療困難，目前只能通過手術(shù)治療，但花費(fèi)巨大，為患兒帶來身體的痛苦，更可能造成家庭嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，通過產(chǎn)前診斷篩選，確定胎兒是否患有CHD，根據(jù)產(chǎn)前診斷結(jié)果對(duì)胎兒的預(yù)后進(jìn)行更準(zhǔn)確、合理評(píng)估十分重要。但以往檢查方法中，若超聲檢查顯示胎兒心臟有畸形或其他畸變，通常只進(jìn)行常規(guī)的染色體核型分析，分析無異常便判定胎兒未患CHD。胎兒出生后，進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)患有22q11微缺失綜合征，該疾病會(huì)造成人體多個(gè)系統(tǒng)、器官的缺陷，包括CHD、唇裂和腭裂、心胸發(fā)育不良、認(rèn)知障礙、免疫力低下等[10]。這顯示了染色體核型分析法在CHD產(chǎn)前診斷上精確性不足的問題，因此目前普遍引進(jìn)并采用分辨率、準(zhǔn)確性更高，敏感度、特異性更強(qiáng)的FISH檢查法進(jìn)行CHD產(chǎn)前診斷[11]。

22q11微缺失是指22號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶2亞帶內(nèi)22q11.21～22q11.23這一固定區(qū)域的雜合性缺失，與CHD密切相關(guān)。22q11微缺失綜合征的新生兒患病率在1/6 000～1/4 000且不同性別患病率無顯著差異，該綜合征會(huì)導(dǎo)致多種生理缺陷，涉及多個(gè)重要臟器，包括心臟畸形、面部異常、唇裂和腭裂、胸腺發(fā)育不良等，且隨著疾病進(jìn)展，患兒的認(rèn)知學(xué)習(xí)能力、精神狀態(tài)、身體發(fā)育等都會(huì)出現(xiàn)異?；蜻t緩；臨床表型主要有CHD、圓錐動(dòng)脈干-面部異常綜合征、腭-心-面綜合征(VCFS)及迪格奧爾格綜合征?，F(xiàn)今仍沒有關(guān)于遺傳病的有效治療手段，從優(yōu)生優(yōu)育角度出發(fā)，防止患重大先天性疾病患兒的出生是主要手段，而準(zhǔn)確、有效的產(chǎn)前診斷是降低患病患兒出生率的重要方法。

目前研究指出22q11微缺失主要是由于染色體在減數(shù)分裂后期進(jìn)行重組時(shí)出現(xiàn)了不對(duì)稱等異?，F(xiàn)象造成的，該微片段的缺失會(huì)造成新生兒多方面的身體缺陷，主要包括DiGeorge綜合征、錐干型心臟畸形、VCFS等，其他22q11缺失的表型還有低血鈣癥、免疫功能低下等。22q11微缺失片段在D22S427/1638到D22S306/308區(qū)間內(nèi)，片段大小1.5～3.0 Mb，小于染色體核型分析的分辨率下限5 Mb，因此需要分辨率更高的技術(shù)手段才能進(jìn)行檢測(cè)[12]。FISH檢查法通過特異性探針與羊水細(xì)胞雜交，檢測(cè)TUPLE1基因，可用于判定胎兒是否存在22q11微缺失，可為22q11微缺失CHD疑似胎兒的產(chǎn)前診斷提供更可靠的檢測(cè)依據(jù)，為遺產(chǎn)咨詢、優(yōu)生優(yōu)育提供參考，有利于下一步及時(shí)的臨床干預(yù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

本研究中的52例孕婦羊水細(xì)胞的染色體核型分析均顯示無異常，而FISH檢查有3例呈陽性，陽性病例中有2例是室間隔缺損的指征，說明22q11微缺失可能與胎兒心臟室間隔缺損有較大相關(guān)性，最終陽性病例均選擇了引產(chǎn)終止妊娠。另20例彩色多普勒超聲顯示胎兒有心臟畸形、22q11微缺失高風(fēng)險(xiǎn)的病例最終FISH檢測(cè)結(jié)果呈陰性，說明CHD是多基因遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，未來還需對(duì)CHD的病因進(jìn)行更深入的分析以指導(dǎo)診斷與治療[13]。目前對(duì)于患有22q11微缺失綜合征新生兒的治療方法有手術(shù)治療心臟畸形，手術(shù)整形、矯正腭及面部異常，加強(qiáng)補(bǔ)鈣治療低血鈣癥，存在語言、認(rèn)知、行動(dòng)發(fā)育緩慢者，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行早教干預(yù)加以控制，以期慢慢得到改善。

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Application of FISH in the prenatal diagnosis of congenital heart disease

ZHAOJing,HUANGXiang,LIHong-yan,LIANGShao-xia

(PrenatalDiagnosisCenter,BoaiHospitalofZhongshanCity，Zhongshan，Guangdong528400,China)

Objective To investigate the detection of 22q11 micro-deletion by FISH in the prenatal diagnosis of congenital heart disease.Methods 52 pregnant women admitted to Boai Hospital of Zhongshan City during March 2012 to October 2014 who were suspected pregnancy 22q11 micro-deletion fetuses were received conventional chromosome karyotyping and FISH test for prenatal diagnosis about 22q11 micro-deletion,then were followed up.Results None of the karyotype analysis results showed abnormal,while there were 3 positive cases tested by FISH.Conclusion Karyotype analysis cannot detect 22q11 micro-deletion syndrome,hence FISH should be used in the prenatal diagnosis for fetuses with the risk of congenital heart disease caused by 22q11 micro-deletion,which can improve the accuracy of detection.

22q11 micro-deletion;FISH;congenital heart disease;prenatal diagnosis

趙婧，女，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞遺傳學(xué)臨床研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.025

A

1672-9455(2015)23-3512-03

2015-04-02

2015-06-29)