化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法在測定他克莫司血藥濃度中的作用

汪 濤

(陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 725000)

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·論 著·

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法在測定他克莫司血藥濃度中的作用

汪 濤

(陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 725000)

目的 評價(jià)分析化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)在測定他克莫司血藥濃度檢測中的作用。方法 回顧性分析西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集的60例肝腎移植患者血液標(biāo)本，并將收集的血液標(biāo)本均實(shí)施CMIA測定他克莫司血藥濃度，同時(shí)采用Architect i2000自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)對他克莫司定值質(zhì)控品連續(xù)測定5 d，計(jì)算他克莫司定值質(zhì)控品斜率、非線性度、截距、漂移度和攜帶污染率。結(jié)果 連續(xù)測定5 d各水平質(zhì)控品測定值和靶值的偏差在允許范圍內(nèi)，總不精密度(CV)也在可以接受的范圍內(nèi)；同時(shí)連續(xù)測定5 d他克莫司質(zhì)控品截距平均值為12.17，非線性度平均值為0.65，斜率平均值為7.62，漂移度平均值為0.15，攜帶污染率為-0.12%，斜率和截距差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶污染率、非線性度及漂移度和用刻度因子(中值-低值)進(jìn)行校正后斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。335份血液標(biāo)本濃度在3～20 μg/L的治療濃度范圍內(nèi)有281份，占83.89%。結(jié)論 CMIA在他克莫司免疫抑制劑血藥濃度測定中具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，同時(shí)性能指標(biāo)也符合臨床基本要求，可以作為他克莫司免疫抑制劑血藥濃度檢測首選方法。

血藥濃度監(jiān)測；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；他克莫司；精密度

他克莫司是臨床應(yīng)用較為廣泛的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，目前被廣泛應(yīng)用在接受器官移植的患者。他克莫司血藥濃度監(jiān)測不僅能夠?yàn)榕R床醫(yī)生制訂和調(diào)整用藥方案提供重要依據(jù)，同時(shí)對保證臨床藥物應(yīng)用的安全性和有效性也具有重要的作用和價(jià)值[1]。目前國內(nèi)外血藥濃度測定的方法主要有高效毛細(xì)管電泳法、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)、微粒子酶免疫法[2]。其中CMIA是測定免疫抑制劑血藥濃度的一種高靈敏度的監(jiān)測新方法。本研究為了分析CMIA在測定他克莫司血藥濃度中的效果，特對60例來自2012年10月到2014年10月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受肝腎移植患者血液標(biāo)本進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年10月到2014年10月來西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受腎移植或肝移植患者的臨床資料，共60例，其中男34例、女26例，年齡15～70歲、平均(42.63±5.74)歲，平均體質(zhì)量(64.75±2.34)kg。本組所有患者均實(shí)施他克莫司藥物治療，他克莫司每隔12 h服藥一次，肝移植患者劑量為0.1～0.2 mg/kg,腎移植患者劑量為0.15～0.30 mg/kg,分2次口服。血樣標(biāo)本采集時(shí)間為患者服藥前30 min，每例患者分別取3 mL上肢靜脈血液，并放置在EDTA-K2抗凝管中，患者所有血標(biāo)標(biāo)本均在當(dāng)日進(jìn)行檢測，共檢測335份血液標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 CIMA主要采用美國雅培公司生產(chǎn)的Architect i2000自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)及其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和配套的Tacrolimus試劑盒；質(zhì)控品為美國BIO-RAD公司提供的定值質(zhì)控品，他克莫司定值質(zhì)控品的低值為4.90 ng/mL，中值為12.10 ng/mL，高值為20.70 ng/mL。漩渦混合器主要采用德國IKA公司生產(chǎn)的Votex Genius3型號。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本處理 CMIA測定血標(biāo)標(biāo)本時(shí)，常規(guī)開機(jī)后，24 h運(yùn)轉(zhuǎn)，并給予常規(guī)保養(yǎng)，將試劑放置在儀器試劑倉中，配套標(biāo)準(zhǔn)品在定標(biāo)后每次測試需要進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。然后將所有的質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣品均按照以下測定方式進(jìn)行分析：首先在1.5 mL離心管中加入200 μL樣品，然后再加入200 μL前處理液，并采用漩渦混合器進(jìn)行充分漩渦，再在13 000 r/min高速臺(tái)式離心機(jī)(美國Heraeus公司生產(chǎn))下離心6 min。離心結(jié)束后將上清液順序倒入樣品杯中上機(jī)測試，30 min后自動(dòng)打印測試結(jié)果。另外應(yīng)保證所有質(zhì)控品全部在控。他克莫司藥物最低檢測限值小于或等于15.0 ng/mL，線性范圍為2.0～30.0 ng/mL。

1.3.2 定值質(zhì)控品的處理 采用1.3.1標(biāo)本處理方法每天按照中、中、高、低、中、中、低、低、高、高、中的順序?qū)Χㄖ蒂|(zhì)控品測定各1次，其中前2個(gè)中值檢測結(jié)果不納入研究，而后幾項(xiàng)檢測中，若有1個(gè)不合格時(shí)應(yīng)對該批所有數(shù)據(jù)進(jìn)行重新測定，連續(xù)5 d記錄有效數(shù)據(jù)，同時(shí)保證所有質(zhì)控品全部在控。

1.3.3 兩種質(zhì)控品檢測結(jié)果評定方式 采用Architect i2000自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)對他克莫司質(zhì)控品進(jìn)行檢測評價(jià)：(1)測定值和靶值偏倚分析時(shí)，計(jì)算每天各水平質(zhì)控品測定值均值和各級質(zhì)控品測定值總均值和靶值的差值，同時(shí)根據(jù)差值不超過±15%×靶值的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷差值是否在可以接受的范圍內(nèi)。(2)總不精密度(CV)的接受范圍，總CV接受范圍主要根據(jù)文獻(xiàn)提供的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)采用試劑盒說明書提供的CV允許范圍(CV<8%)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷總CV接受范圍。(3)質(zhì)控品測定結(jié)果多元回歸分析，采用多元回歸分析法對質(zhì)控品測定值進(jìn)行分析，同時(shí)計(jì)算其斜率、非線性度、截距、漂移度和攜帶污染率。

2 結(jié) 果

2.1 他克莫司質(zhì)控品測定值與靶值偏差分析 見表1。采用Architect i2000自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)對他克莫司質(zhì)控品連續(xù)5 d中、高低各水平質(zhì)控品測定值均值和靶值的結(jié)果分析得知，連續(xù)測定5 d各水平質(zhì)控品測定值和靶值偏差在允許范圍內(nèi)。

2.2 總CV分析結(jié)果 見表2。由他克莫司各級質(zhì)控品測定結(jié)果可以得出總CV，分析結(jié)果可以得知，連續(xù)測定5 d各水平質(zhì)控品測定值和靶值的總CV在可以接受的范圍內(nèi)。

2.3 CMIA檢測60例患者臨床血液標(biāo)本結(jié)果分析 本研究采用CMIA檢測60例患者335份血液標(biāo)本分析得知，335份血液標(biāo)本濃度在3～20 μg/L的治療濃度范圍內(nèi)有281份，占83.89%，見表3。

2.4 移植后不同時(shí)間測定結(jié)果分析 見表4。將他克莫司全血濃度測定按照移植后時(shí)間進(jìn)行分組比較標(biāo)本頻率和血藥濃度平均值可以得知，移植后不同患者他克莫司全血濃度實(shí)測值相差較大，說明存在較大的個(gè)體差異。

表1 他克莫司各級質(zhì)控品測定結(jié)果分析(ng/mL)

注：D=Y-C；允許偏差范圍為±15%×靶值。

表2 他克莫司質(zhì)控品連續(xù)5 d檢測各水平質(zhì)控品CV結(jié)果

注：t=S-R/3,當(dāng)T<0.00時(shí)，計(jì)為0.00；U=R+T；V=U1/2;CV=V/總均值×100%。

表3 335份血液標(biāo)本全血濃度測定范圍

表4 不同時(shí)間他克莫司全血濃度測定結(jié)果分析

2.5 多元回歸分析 通過對本研究連續(xù)測定5 d他克莫司各級水平質(zhì)控品分析，并通過對他克莫司質(zhì)控品斜率、非線性度、截距、漂移度和攜帶污染率分析得知，連續(xù)測定5 d他克莫司質(zhì)控品截距的平均值為12.17，非線性度平均值為0.65，斜率平均值為7.62，漂移度平均值為0.15，攜帶污染率為-0.12%。其中斜率和截距差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶污染率、非線性度及漂移度和用刻度因子(中值-低值)進(jìn)行校正后斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

他克莫司是目前臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，此種藥物首次用于臨床是在1989年，其主要是從駐波鏈霉菌中發(fā)酵、純化分離出來的一種新型的免疫抑制劑。國外有關(guān)學(xué)者研究表明，他克莫司的免疫抑制作用主要是通過對T細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-3、干擾素而達(dá)到抑制作用，其不僅能夠有效提高移植后腎存活率，同時(shí)對降低不良反應(yīng)也具有重要作用[3]。目前此種藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在預(yù)防移植患者急性或者慢性排斥反應(yīng)中，但是由于他克莫司藥物個(gè)體吸收率和清除率差別較大，同時(shí)具有治療范圍狹窄及口服吸收生物利用度低，用藥劑量與血藥濃度缺乏緊密的相關(guān)性，從而增加臨床給藥的難度[4-5]。因此，在使用他克莫司對肝腎移植患者治療中，應(yīng)注意對患者的血藥濃度進(jìn)行測定，及時(shí)根據(jù)患者的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整藥物，最大限度減少藥物對患者腎臟的損壞，抑制不良反應(yīng)發(fā)生。

目前臨床常用的監(jiān)測血藥濃度的方法有微粒子酶免疫法、高效液相色譜法及化學(xué)發(fā)光法等，不同的檢測方法由于檢測原理不同，對標(biāo)本提取的方法及對代謝物識別方法不同等，所以檢測結(jié)果也有所不同。近年來，臨床最常用的檢測他克莫司免疫抑制劑的方法為微粒子酶免疫分析法(MEIA)。但是隨著CMIA的推出，CMIA逐漸將MEIA代替。CMIA是近年來發(fā)展起來的一種新型的高靈敏度檢測技術(shù)，其技術(shù)原理主要為：首先采用吖啶酯進(jìn)行標(biāo)記他克莫司分子作為酶競爭物，然后采用他克莫司單克隆抗體包被的順次微珠作為捕獲物。在對檢測血液樣品進(jìn)行測定時(shí)，首先對樣品進(jìn)行前處理，再將處理完后的樣品和包被單抗的順次微珠相互混合，加入吖啶酯標(biāo)記的他克莫司作為酶競爭物，并與微珠上的他克莫司藥物抗體進(jìn)行結(jié)合，接種采用磁場促使微珠分離，清洗后再將預(yù)激法和激發(fā)試劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出他克莫司的濃度[6]。美國雅培公司生產(chǎn)的試劑盒就是根據(jù)此原理進(jìn)行設(shè)計(jì)的。另外，多數(shù)學(xué)者研究表明，美國雅培公司生產(chǎn)的CMIA他克莫司測定試劑盒在Architect i2000自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)中應(yīng)用，不僅自動(dòng)化程度高，同時(shí)其準(zhǔn)確性和精密度也非常高，目前此種技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但是由于此系統(tǒng)價(jià)格和維修費(fèi)用較高，所以基層醫(yī)院使用較少[7]。另外還有研究表明，Architect i2000自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)中配套使用的他克莫司檢測試劑盒的包被載體為此類顆粒，其不僅能夠有效增加反應(yīng)表面積，提高檢測的靈敏度，縮短檢測時(shí)間，同時(shí)在檢測中通過采用磁力吸附法進(jìn)行分離磁顆粒能夠進(jìn)一步提高檢測的特異性[8]。

本研究結(jié)果表明，連續(xù)測定5 d各水平質(zhì)控品測定值和靶值的偏差以及總CV均在允許接受的范圍內(nèi)，同時(shí)連續(xù)測定5 d他克莫司質(zhì)控品截距平均值為12.17，非線性度平均值為0.65，斜率平均值為7.62，漂移度平均值為0.15，攜帶污染率為-0.12%，斜率和截距差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明定值質(zhì)控品測定值和參考值具有恒定誤差；攜帶污染率、非線性度、漂移度和用刻度因子(中值-低值)進(jìn)行校正后斜率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明CMIA具有非常好的線性關(guān)系。關(guān)于肝腎移植后他克莫司的理想治療范圍一般推薦為移植后初期12 h全血濃度在5～20 ng/mL。本研究結(jié)果顯示，335份血液標(biāo)本濃度在3～20 μg/L的治療濃度范圍內(nèi)有281份，占83.89%，移植后不同患者他克莫司全血濃度實(shí)測值相差較大，說明存在較大的個(gè)體差異。因此臨床應(yīng)針對檢測結(jié)果，構(gòu)建新的治療窗，同時(shí)加強(qiáng)與臨床醫(yī)生和藥師之間的溝通，能夠?yàn)榕R床肝和腎移植患者制訂切實(shí)、有效、合理的治療方案，最大限度減少肝和腎移植患者臨床用藥的不良反應(yīng)及排斥反應(yīng)，提高患者預(yù)后[9]。

綜上所述，他克莫司免疫抑制劑血藥濃度測定中CMIA的應(yīng)用，不僅準(zhǔn)確度和精密度較高，同時(shí)攜帶污染率及漂移度對CMAI測定結(jié)果沒有影響，性能指標(biāo)可靠性高。另外，應(yīng)注意由于不同患者個(gè)體間的他克莫司吸收和代謝存在差異，因此臨床對患者實(shí)施他克莫司治療應(yīng)定期監(jiān)測血藥濃度，根據(jù)血藥濃度給予患者最佳的劑量，減少毒副反應(yīng)。

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Effect of CMIA on the determination of tacrolimus

WANGTao

(DepartmentofClinicalLaboratory,AnkangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Ankang,Shaanxi725000,China)

Objective To analyze and evaluate the effect of chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) on determination of tacrolimus.Methods 60 cases of blood samples were collected from patients received liver or renal transplantation in the First Affiliated Hospital of Xi ′an Jiaotong University,and detected the blood concentration of tacrolimus by CMIA.Architect i2000 automatic immunoassay system was used to detect the quality controls of tacrolimus for 5 d in a row,so as to calculate the slope,nonlinearity,intercept,driftance and contamination rate of tacrolimus fixed value quality control.Results After 5-day continuous detection,the results showed that the deviations between measured values and target values of the quality controls with different tarcrolimus concentrations as well as the coefficient of variation (CV) were within the allowable range.The average intercept,nonlinearity,slope,driftance and contamination rate of 5-day continuous detection were 12.17,0.65,7.62,0.15,and -0.12%,respectively.The differences both of slope and intercept were significant (P<0.05).The contamination rate,nonlinearity,driftance,and the slope correction with calibration factors (median value-low value) had no significantly difference (P>0.05).Among 335 cases of samples,there were 281 cases (83.89%),within the tarcrolimus therapeutic range (3-20 μg/L).Conclusion The CMIA determination of tacrolimus has good tightness and accuracy,and its performance indicators also meet the clinical basic requirements.It is a preferred method for the detection of tacrolimus concentration in blood.

determination of blood drug concentration;chemiluminescent microparticle immunoassay; tacrolimus;precision

汪濤，男，本科，主管檢驗(yàn)師，主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.021

A

1672-9455(2015)23-3502-03

2015-03-09

2015-06-15)