16S rDNA測(cè)序技術(shù)在嬰兒腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用*

馬麗亞,王輝林,陳 睿,張 敏，黃 艷,盧光進(jìn)△

(深圳市寶安區(qū)婦幼保健院:1.新生兒科;2.中心實(shí)驗(yàn)室 518133)

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·論 著·

16S rDNA測(cè)序技術(shù)在嬰兒腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用*

馬麗亞1,王輝林2,陳 睿1,張 敏1，黃 艷1,盧光進(jìn)1△

(深圳市寶安區(qū)婦幼保健院:1.新生兒科;2.中心實(shí)驗(yàn)室 518133)

目的 探討16S rDNA測(cè)序技術(shù)在新生兒、嬰兒腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用。方法 于生后3天、1月、6月、1歲時(shí)收集2例健康嬰兒糞便標(biāo)本共8份，提取細(xì)菌總DNA，以Illumina Hiseq 2000為測(cè)序平臺(tái)，采用新一代高通量16S rDNA宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)V6可變區(qū)測(cè)序，并進(jìn)行生物信息分析(物種分類和豐度分析；多樣性分析)。結(jié)果 8份樣品共產(chǎn)生原始測(cè)序數(shù)據(jù)為1 027.47 Mbp，Unique tags序列數(shù)量均值為58630，OTU數(shù)量63～209；優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria和Firmicutes； 在科水平，>1%的物種1個(gè)月之內(nèi)2～4種，6月后達(dá)7～10種；1號(hào)嬰兒一直以Enterobacteriaceae占優(yōu)勢(shì)，2號(hào)嬰兒優(yōu)勢(shì)菌群包括Enterobacteriaceae、Lachnospiraceae、Streptococcaceae和Bacteroidaceae；4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的npShannon和Simpson指數(shù)分別為1.17、1.29、2.16、2.51和0.43、0.40、0.26、0.14。結(jié)論 16S rDNA測(cè)序技術(shù)能滿足新生兒、嬰兒腸道微生態(tài)研究需求；新生兒、嬰兒糞便中含豐富細(xì)菌基因組；細(xì)菌物種豐度及分類存在個(gè)體差異；從出生到1歲，嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)趨向復(fù)雜和多樣。

腸道菌群; 測(cè)序; 宏基因組; 嬰兒

寄居于人體內(nèi)(主要是腸道)的細(xì)菌基因組是人體自身基因組的100多倍[1-2]，被稱為人類的“第二基因組”[3]，腸道菌群對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、對(duì)抗病菌及免疫調(diào)節(jié)都發(fā)揮著重要作用[4]。新生兒、嬰兒期是人體腸道菌群定植并發(fā)育的重要階段，此期腸道菌群的失衡可能影響遠(yuǎn)期甚至成年后的健康[1]。因而，了解新生兒、嬰兒期腸道菌群的發(fā)展模式及特點(diǎn)對(duì)研究相關(guān)疾病、改善人口質(zhì)量有重要意義。

對(duì)腸道微生態(tài)的研究以往多采用培養(yǎng)或傳統(tǒng)分子生物學(xué)(如PCR、變性梯度凝膠電泳)方法，但它們對(duì)于研究復(fù)雜的腸道菌群有明顯的局限性，而宏基因組學(xué)研究則可以避免上述方法的缺陷[5]。最近，有關(guān)中國(guó)嬰兒腸道宏基因組的研究初見(jiàn)報(bào)道[6]，但缺乏連續(xù)性研究和新生兒資料，本研究擬采用以Illumia為測(cè)序平臺(tái)的16S rDNA新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2例健康嬰兒從新生兒期至1歲以內(nèi)的糞便細(xì)菌基因組進(jìn)行連續(xù)分析，探討該方法在新生兒、嬰兒腸道微生態(tài)研究中的應(yīng)用，為以后大規(guī)模研究中國(guó)嬰兒腸道菌群分布特征及嬰兒腸道微生態(tài)相關(guān)疾病提供參照。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2例間隔1周出生于深圳市寶安區(qū)婦幼保健院同一病區(qū)的健康足月新生兒為研究對(duì)象，追蹤至1歲。2例嬰兒胎齡分別為38周、39周，均為女孩，剖宮產(chǎn)出生，無(wú)胎膜早破，無(wú)產(chǎn)時(shí)窒息，母親術(shù)后預(yù)防性應(yīng)用頭孢唑啉2劑，生后一直混合喂養(yǎng)至1歲。本課題經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意并獲得了嬰兒父母的知情同意。

1.2 糞便標(biāo)本的留取及提取細(xì)菌總DNA 生后3 d(時(shí)間點(diǎn)標(biāo)注為a)、1月(標(biāo)注為b)、6月(標(biāo)注為c)和1歲(標(biāo)注為d)時(shí)用無(wú)菌標(biāo)本盒留糞便不少于10 g，1 h內(nèi)冷凍于-70 ℃，留取糞便前1周嬰兒不使用抗生素、益生菌，如有疾病，可暫緩1周留取。在本院中心實(shí)驗(yàn)室采用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便細(xì)菌總DNA，保存于-70 ℃，具體步驟由專人按說(shuō)明書(shū)操作。DNA標(biāo)本于冷藏條件下送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序及生物信息分析。

1.3 16S rDNA測(cè)序 用細(xì)菌通用引物對(duì)糞便DNA樣品進(jìn)行16S rRNA基因V6區(qū)PCR擴(kuò)增，然后回收電泳主要的DNA片段后構(gòu)建文庫(kù)，制備cluster；應(yīng)用Hiseq 2000測(cè)序儀(Illumina公司，美國(guó))對(duì)擴(kuò)增的16S rDNA高變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序區(qū)域?yàn)閂6區(qū)，長(zhǎng)度為100 bp，測(cè)序類型為101 PE測(cè)序。

1.4 生物信息分析

1.4.1 物種分類與豐度分析 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)處理后獲取clean data，拼接成tags；利用Mothur (version 1.27.0)軟件包對(duì)tags序列進(jìn)行了去冗余處理，從中挑選出unique tags序列并進(jìn)行物種注釋，聚類成Operational Taxonomic Units (OTU)，Tags和OTU的數(shù)量初步說(shuō)明了該樣品是否具有豐富的物種；然后通過(guò)OTU 注釋(基于包含的tags的物種注釋結(jié)果)完成物種組成和分類分析，可在界、門、綱、目、科、屬、種水平，將每個(gè)注釋上的物種或OTU在不同樣品中的序列數(shù)進(jìn)行整理。

1.4.2 多樣性分析 利用Mothur(version 1.27.0)軟件計(jì)算針對(duì)單個(gè)樣品物種多樣性分析的Alpha多樣性值，包括chao1值、ACE值、Shannon、npShannon以及Simpson指數(shù)[7]，前面4個(gè)指標(biāo)數(shù)值越大，最后一個(gè)指標(biāo)越小，說(shuō)明樣品中的物種越豐富。

2 結(jié) 果

2.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù) 8份糞便細(xì)菌總DNA樣品共產(chǎn)生原始測(cè)序數(shù)據(jù)為1 027.47 Mbp，每份樣品平均產(chǎn)生124.53 Mbp的clean data序列，每一樣品信息的利用率都在94%以上，出生僅3 d時(shí)已含豐富的細(xì)菌基因組。

2.2 物種分類和豐度分析 各樣品檢測(cè)的Tags數(shù)量平均為69 840，Unique tags序列數(shù)量均值為58 630；OTU數(shù)量63～209，隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，3 d、1月、6月和1歲時(shí)平均為67、86、149和176，表明嬰兒糞便樣品中微生物豐度隨時(shí)間而增加。在門(Phylum)水平，20個(gè)菌門被檢出細(xì)菌基因組，但主要分布于變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)2個(gè)菌門，2例嬰兒糞便中比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，2號(hào)嬰兒的擬桿菌門(Bacteroidetes)在1歲時(shí)上升至22%。見(jiàn)表1。

表1 門水平主要細(xì)菌占比情況表[tags數(shù)量及百分比，n(%)]

注：a、b、c、d分別代表3 d、1月、6月、1歲4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

本研究中最佳的分類水平為科，每個(gè)樣品均有80%以上的Tags在該水平上得到分類。在科水平，2例嬰兒腸道菌群中超過(guò)1%的物種1個(gè)月之內(nèi)僅2～4種，6月后達(dá)7～10種。1號(hào)嬰兒一直以Proteobacteria下的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)占優(yōu)勢(shì)，其他包括Firmicutes下的梭菌科(Clostridiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)等，雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)一直未超過(guò)1%。2號(hào)嬰兒優(yōu)勢(shì)菌群包括Enterobacteriaceae以及Firmicutes下的毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)和Bacteroidetes下的擬桿菌科(Bacteroidaceae)，雙歧桿菌科最高時(shí)也僅7.3%。

表2 樣品在0.03距離下的不同時(shí)間點(diǎn)Alpha豐富 程度各指數(shù)均值

2.3 樣品多樣性分析 3 d、1月、6月及1歲時(shí)chao1值、ACE值、Shannon、npShannon值越來(lái)越大，而Simpson指數(shù)越來(lái)越小，提示糞便中菌群多樣性隨著時(shí)間而增加，物種越來(lái)越豐富。見(jiàn)表2。

3 討 論

高通量測(cè)序技術(shù)又稱新一代或第二代測(cè)序技術(shù)，以邊合成邊測(cè)序?yàn)樵恚梢砸淮涡詫?duì)幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，而以Illumina為測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序技術(shù)在研究人類腸道宏基因組方面發(fā)揮著舉足輕重的作用[2-3,6,8]。16S rDNA是細(xì)菌進(jìn)化以及分類研究最常用的靶分子，16S rDNA宏基因測(cè)序技術(shù)不需進(jìn)行克隆篩選，測(cè)序的通量高，獲得的數(shù)據(jù)量大，周期短，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定和PCR、變性梯度凝膠電泳、原位雜交等分子生物學(xué)方法相比，能更全面反映微生物群體的物種組成、分布及豐度信息。本研究對(duì)2例剖宮產(chǎn)出生、混合喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便標(biāo)本于1歲之內(nèi)連續(xù)進(jìn)行16S rDNA的V6高變區(qū)新一代高通量測(cè)序，8份糞便細(xì)菌總DNA樣品共產(chǎn)生原始測(cè)序數(shù)據(jù)為1 027.47 Mbp，每份樣品平均產(chǎn)生124.53 Mbp的clean data序列。Barrett等[9]對(duì)10例早產(chǎn)兒生后2周和4周的糞便標(biāo)本進(jìn)行16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析(Genome Sequencer FLX測(cè)序平臺(tái)，Roche Diagnostics Ltd,West Sussex，UK)，20份標(biāo)本共產(chǎn)生529 102 bp原始序列和452 863 bp clean data 序列，本研究測(cè)序數(shù)據(jù)多于Barrett等對(duì)于早產(chǎn)兒、新生兒的報(bào)道，原因可能與測(cè)序平臺(tái)、嬰兒胎齡、日齡不同有關(guān)，同時(shí)也表明以Illumina為測(cè)序平臺(tái)的16S rDNA測(cè)序技術(shù)能夠滿足新生兒、嬰兒腸道微生態(tài)研究的需求。

影響新生兒腸道菌群定植的因素包括分娩方式[10]和喂養(yǎng)方式[6]等，例如，剖宮產(chǎn)出生的嬰兒其腸道菌群多樣性減少、益生菌擬桿菌門定植延遲[10]；母親腸道是陰道分娩嬰兒腸道菌群定植的發(fā)源地，而母乳中的細(xì)菌以及通過(guò)吸吮接觸乳頭周圍的皮膚是母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道菌群的重要來(lái)源[1]；母親圍生期使用抗菌藥物可改變其嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)[11]。本研究中 2例嬰兒雖然出生環(huán)境及圍產(chǎn)期因素相似(同一產(chǎn)區(qū)、均為剖宮產(chǎn)出生、混合喂養(yǎng)、母親產(chǎn)時(shí)均有預(yù)防性抗菌藥物應(yīng)用)，但糞便中的菌群分布卻有明顯的差異，說(shuō)明除了以上常見(jiàn)影響因素外，尚有其他影響嬰兒腸道細(xì)菌定植的因素，如地域[11]，家庭環(huán)境(如寵物)或兄弟姐妹的影響[12]等，從而造成嬰兒腸道宏基因組獨(dú)特的個(gè)體特征，但這些結(jié)論還需要大標(biāo)本、多地域人群的連續(xù)研究來(lái)證實(shí)。另外，常見(jiàn)的益生菌雙歧桿菌科在2例嬰兒腸道中的比例均較低，與Fan等[6]的研究類似。

不同于Fan等[6]僅一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的研究，本研究表明，新生兒出生僅3 d時(shí)腸道中已含有豐富的細(xì)菌基因組，從出生到1歲，嬰兒糞便中細(xì)菌豐度及多樣性隨時(shí)間而增加，提示隨著嬰兒飲食結(jié)構(gòu)的復(fù)雜和個(gè)體的發(fā)育，以及活動(dòng)范圍的擴(kuò)展，嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)趨向復(fù)雜和多樣。但值得注意的是，出生不久即定植的優(yōu)勢(shì)菌群，1歲以內(nèi)可能會(huì)一直存在，例如1號(hào)嬰兒腸道中一直以腸桿菌科占優(yōu)勢(shì)，而2號(hào)嬰兒腸道中自1月時(shí)出現(xiàn)的毛螺旋菌科此后亦一直為優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明生命早期的因素可能會(huì)影響1歲以內(nèi)甚至兒童、成人期的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

本研究提示，16S rDNA測(cè)序技術(shù)能滿足新生兒、嬰兒腸道微生態(tài)研究需求；嬰兒糞便中含豐富細(xì)菌基因組；細(xì)菌物種豐度及分類存在個(gè)體差異；從出生到1歲，嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)趨向復(fù)雜和多樣；本研究將為未來(lái)新生兒、嬰兒的大樣本、分組研究提供線索。

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Application of 16S rDNA sequencing technique in infantile intestinal microecological research*

MALi-ya1,WANGHui-lin2,CHENRui1,ZHANGMin1,HUANGYan1,LUGuang-jin1

(1.DepartmentofNeonatology;2.CentralLaboratory,ShenzhenBao′anDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen,Guangdong518133,China)

Objective To investigate the application of 16S rDNA sequencing technique in studying intestinal microecology of neonates and infants.Methods Eight fecal samples were collected on 3 d,1 month,6 months and 1 year in 2 healthy infants.Total bacterial DNAs were extracted and submitted the high throughout 16S rDNA sequencing on the V6 viable region by using Illumia genome analyzer Hiseq 2000 (101 bp pair-end sequencing strategy).The 16S rDNA tags and operational taxonomic units (OTU) were then obtained from the sequences.The bioinformatic analysis including analysis of taxonomy,abundance and alpha diversity were performed.Results Total 1 027.47 Mbp raw data were produced.The mean unique tags number was 58630.The OTU numbers ranged from 36 to 308.The bacterial families more than 1% were increased from 2-4 species per sample before 1 month to 7-10 species after 6 months.Enterobacteriaceae was always the predominant family in No.1 infant through the first year,while in No.2 infant the predominant groups included Enterobacteriaceae,Lachnospiraceae,Streptococcacea and Bacteroidaceae.The mean npShannon and Simpson indexes at 4 time points were 1.17,1.29,2.16,2.51 and 0.43,0.40,0.26,0.14 respectively.Conclusion 16S rDNA sequencing could meet the need of studying intestinal microecology in neonates and infants;neonatal and infantile feces contains abounding bacterial genomes;the individual differences exist in intestinal bacterial abundance and composition;the structure of gut bacterial floras trend to complexity and diversity from birth to 1 year old.

intestinal microbiota; sequencing; metagenomics; infant

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201102030)。

馬麗亞，女，主任醫(yī)師，碩士，研究方向包括新生兒營(yíng)養(yǎng)與腸道微生態(tài)、新生兒肺損傷。

△通訊作者，E-mail:lugj1111@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.011

A

1672-9455(2015)02-0166-03

2014-05-21

2014-10-30)