日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆與表達*

雷 黎，劉 淼，沈際佳△

(1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,合肥 230061;2.安徽醫(yī)科大學

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·論 著·

日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆與表達*

雷 黎1，劉 淼2，沈際佳2△

(1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,合肥 230061;2.安徽醫(yī)科大學

病原生物學教研室,合肥 230032)

目的 獲得日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的原核表達蛋白。方法 根據(jù)GenBank中日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列設計引物，以cDNA為模板聚合酶鏈反應(PCR)擴增該基因，將其亞克隆入原核表達載體pET28a中，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達重組蛋白。結果 成功克隆了具有完整開放閱讀框的日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑重組質(zhì)粒，獲得相對分子質(zhì)量約44×103的目的蛋白。結論 成功地克隆表達了絲氨酸蛋白酶抑制劑，為進一步研究該蛋白的特性、功能及免疫保護作用奠定了基礎。

日本血吸蟲； 絲氨酸蛋白酶抑制劑; 克隆； 表達

在人類寄生蟲病中，就社會經(jīng)濟和公共衛(wèi)生重要性而言，血吸蟲病是僅次于瘧疾的第二重要的熱帶病，是一種嚴重威脅人民健康的人畜共患寄生蟲性傳染病，在我國仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題[1]。因而通過免疫方法繼續(xù)尋找新的血吸蟲抗原分子是非常必要的。作者根據(jù)GenBank中公布的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)的序列設計引物，克隆表達了SPI,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 BL-21大腸埃希菌、表達載體pET28a由本室保存?？寺≥d體pMD18-T、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、聚合酶鏈反應(PCR) Marker、蛋白質(zhì)低分子量的標準品、Tris堿、明膠均購自大連寶生物工程有限公司； 聚合酶鏈反應(PCR)膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州V-gene生物工程有限公司；其他試劑是國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲SPI基因的體外擴增 根據(jù)SPI基因序列，設計一對引物，序列為Primer1:5′-GAA TTC ATG GCA CCA AAA GTT CAA G-3′；Primer2:5′-CTC GAG TTA TAA CAT TGG ATT GAT T-3′。兩條引物分別引入限制性的內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以日本血吸蟲cDNA為模板，PCR反應條件為 94 ℃5 min熱啟動，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，1%瓊脂糖電泳分析。PCR產(chǎn)物膠回收按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 日本血吸蟲SPI基因的克隆與鑒定 將PCR擴增的SPI基因與T載體相連,然后轉(zhuǎn)化XL1-blue；第2天，提取質(zhì)粒,經(jīng)XhoⅠ和ECORⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶。將表達載體pET28a用同樣的兩個酶進行酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶,再與已經(jīng)回收的SPI的PCR產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化BL-21,涂含有卡那霉素的LB平板；第2天，從平板中挑取10個單個菌落，擴大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，用經(jīng)XhoⅠ和ECORⅠ雙酶切鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳。將酶切鑒定正確的克隆送上海生工生物工程有限公司進行序列測定。

1.2.3 日本血吸蟲SPI的表達 將酶切與測序鑒定正確的克隆，加入到含卡那霉素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；再按1∶50的比例擴大培養(yǎng)約3 h，使OD600為0.6左右時，留取1 mL的菌液；剩余的菌液中加入1 mol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在加入IPTG后5 h、12 h收集1 mL的菌液，再將所有收集的菌液均作同樣的處理，4 000 r/min離心5 min，每管中加入30 mL的無菌水重懸細菌和30 mL的2×蛋白上樣緩沖液，沸水浴中煮沸10 min以裂解細菌，4 000 r/min離心5 min，采用12%凝膠,不連續(xù)緩沖系統(tǒng),通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濃縮膠55 V 1 h、分離膠110 V 1.5 h，考馬氏亮藍染色1 h,搖振脫色過夜，觀察結果并拍照。

2 結 果

2.1 日本血吸蟲SPI的PCR擴增 PCR擴增后,1%瓊脂糖電泳后可以見到約1 200 bp大小的條帶,與理論值一致,見圖1。

注：1為SPI的PCR產(chǎn)物，M為DNA標記物。

圖1 SPI的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 日本血吸蟲SPI的重組體的酶切鑒定結果 提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，1%瓊脂糖電泳可見大小兩條帶，可見1 200 bp左右的目的條帶出現(xiàn),與理論大小一致，結果見圖2。

注：1為重組體的酶切鑒切，M為DNA標記物。

圖2 SPI的酶切鑒定結果

2.3 序列分析結果 將測序結果分別與GenBank進行比對,結果顯示本研究克隆入表達載體中的序列為日本血吸蟲SPI，表明重組質(zhì)粒構建成功。

2.4 日本血吸蟲SPI的表達(SDS-PAGE) SDS-PAGE結果顯示,在沒有加入IPTG誘導時,未見明顯特異性條帶出現(xiàn),在加入IPTG后的5 h和12 h后,在相對分子質(zhì)量44×103處可見有明顯條帶出現(xiàn)，與理論值大小相符(圖3)。

注：1為未加IPTG；2為加入IPTG后5 h；3為加入IPTG后12 h,M為蛋白質(zhì)標準物。

圖3 SPI表達的SDS-PAGE圖

3 討 論

日本血吸蟲生活史復雜，有性生殖和無性繁殖交替，中間宿主和終末宿主轉(zhuǎn)換[2]，血吸蟲在演化過程中蟲體內(nèi)仍具有許多種、屬間及各期間高度保守的基因，已知這些高度保守基因序列及其產(chǎn)物在生長、發(fā)育、生殖及血吸蟲與宿主相互關系中發(fā)揮著重要作用，在蟲體的信號傳遞、細胞分化與增殖、蛋白質(zhì)相互作用和宿主免疫誘導反應等生理生命活動中也是至關重要的。

本實驗室在運用對血吸蟲感染有抗性的血清免疫學方法篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫時,在25個陽性克隆中，其中就有2個為日本血吸蟲SPI[3]。而閻玉濤等[4]用對血吸蟲感染存在天然抗性的東方田鼠的血清篩選日本血吸蟲成蟲cDNA 文庫時發(fā)現(xiàn)，所篩選出的51個陽性克隆中有10個為含日本血吸蟲SPI基因的陽性克隆，可見血吸蟲SPI與血吸蟲的免疫逃避機制明顯相關。

SPI屬于絲氨酸蛋白酶超家族，此家族是一類具有共同來源及結構序列高度同源的蛋白酶抑制劑家族[3]。這個家族已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個成員，廣泛分布于動物、植物體和病毒粒子中。SPI具有多種功能，可作為酶的抑制劑起作用，如抑制絲氨酸蛋白酶的活性、抑制纖溶酶原激活劑的活性等。對血吸蟲SPI的功能研究較少,Lim 等[5]發(fā)現(xiàn)，小鼠先注射非肽類SPI，然后進行尾蚴攻擊感染，可使小鼠獲得80%的減蟲率和92%的減卵率。很多學者認為，血吸蟲本身SPI的作用在于該抑制劑與血吸蟲的絲氨酸蛋白酶共價結合后，封閉了絲氨酸蛋白酶的表位，該復合物中絲氨酸蛋白酶的免疫原性消失；同時該抑制劑可抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白從而抑制嗜中性粒細胞對寄生于體內(nèi)血吸蟲的攻擊。

本研究以日本血吸蟲cDNA為模板，選擇不含任何多克隆酶切位點的T載體，當PCR產(chǎn)物在與T載體相連后，轉(zhuǎn)化細菌,提取質(zhì)粒,然后使用PCR引物中引入的限制性內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物酶切下來,不僅極大地提高了PCR產(chǎn)物酶切效率，而且克服了直接酶切,膠回收PCR產(chǎn)物引起的損失,大大提高了PCR產(chǎn)物與相應載體的連接效率，并將其亞克隆入原核表達載體pET28a中，IPTG誘導表達重組蛋白——SPI。SPI是一類從病毒到人類均有分布的蛋白，相對分子質(zhì)量較大，通常由300～500個氨基酸殘基組成。它含有8～9個α-螺旋、3個β-折疊組成的保守三級結構，功能域位于C端，有一個暴露于蛋白主體外的反應中心環(huán)(RCL)，其與抑制蛋白酶的種類和活性密切相關。其中，RCL上的P1位點氨基酸殘基決定了抑制蛋白酶的特異性，SPI可在細胞內(nèi)也可分泌到細胞外發(fā)揮作用，它主要參與寄生蟲與宿主的相互作用，可作用于宿主酶利于蟲體獲取營養(yǎng)，或抵抗宿主酶對蟲體的損傷，或參與調(diào)控宿主的炎癥及免疫應答[6]。重組表達獲得血吸蟲SPI，為進一步研究日本血吸蟲SPI的特性、功能及免疫保護作用，深入了解血吸蟲適應宿主體及對宿主致病的分子機制，發(fā)展基于抑制劑靶點干預的血吸蟲病防治藥物提供參考,也為尋找血吸蟲新保護性候選疫苗分子的研究提供了新思路。

[1]袁忠英,沈玉娟,曹建平.等.東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫及新基因分析[J].中國血吸蟲病防治雜志,2008,20(4)：255-259.

[2]楊燕萍,郭素霞,陳晶,等.編碼日本血吸蟲Argonaute蛋白全長cDNA克隆、表達及初步鑒定[J].中國人獸共患病學報,2010，26(9):830-834. [3]任翠平,王曉楠,雷黎,等.血吸蟲感染抗性人血清篩選日本血吸蟲童蟲eDNA文庫[J].中國地方病學雜志,2007,26(5)：490-493.

[4]閻玉濤,劉述先,宋光承,等.東方田鼠天然抗體相關的日本血吸蟲抗原基因篩選和克隆[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2001,19(3)：153-156.

[5]Lim KC,Sun E,Bahgat M,et al． Block-age of skin invasion by schistosome cercariae by serine protease inhibitors [J]．Am J Trop Med Hyg,1999,60(3):487-492．

[6]李暉,彭禮飛.寄生線蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑研究進展[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志,2011,39(6):344-349.

Cloning and expressing of Schistosoma japonicums serine protease inhibitor*

LEILi1,LIUMiao2,SHENJi-jia2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei,Anhui230061,China;2.ResearchandTeachingSectionofPathogenicBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

Objective To obtain Schistosoma japonicums serine protease inhibitor(SPI) prokaryotic express protein.Methods The primer was designed on the basis of sequence of Schistosoma japonicum SPI in Genbank,the PCR method was used to amplify the gene with cDNA as the template.Then the product was subcloned into prokaryotic expression vector pET28a,IPTG induced to express the recombination protein.Results The Schistosoma japonicums SPI recombinant plasmid with complete patency reading frame was successfully cloned and the interest protein with the relative molecular mass 44×103was obtained.Conclusion SPI is successfully cloned and expressed,which lays the foundation for the further study of the protein′s character,function and immunoprotection effect.

Schistosoma japonicum; serine protease inhibitor; clone; express

安徽省自然科學基金項目(050430805)。

雷黎，男，副主任技師，碩士研究生，日本血吸蟲分子免疫學，主要從事臨床分子免疫學工作。

△通訊作者，E-mail：shenjijia@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.004

A

1672-9455(2015)02-0151-02

2014-05-22

2014-11-06)