Pl3K、Akt和mTOR在無功能性垂體腺瘤中的表達(dá)

李 鵬，張慶九，馬 法，劉 嵐，李旭蕊，李曉燕

（1.河北省石家莊市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊050000；3.河北省石家莊市裕華區(qū)婦幼保健站婦產(chǎn)科，河北 石家莊050000；4.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊050031）

無功能性垂體腺瘤（non-functioning pituitary adenomas，NFPAs）占垂體腺瘤的20%～30%，NFPAs與功能性垂體腺瘤（functioning pituitary adenomas，F(xiàn)PAs）相比不具有明顯的內(nèi)分泌功能，早期不易被發(fā)現(xiàn)，隨著瘤體生長壓迫鄰近組織，才表現(xiàn)出局部壓迫的臨床癥狀，此時(shí)已嚴(yán)重影響相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)功能，手術(shù)治療很難將其完全切除，術(shù)后亦容易復(fù)發(fā)，故治愈NFPAs存在一定難度。磷脂酰肌 3-激 酶 （phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）／（serine／threonine kinase，Akt）／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對肺癌、血液系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)及婦科腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。本研究探討PI3K、Akt、mTOR在NFPAs及FPAs中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討3種因子在NFPAs及FPAs中的表達(dá)差異，期待為NFPAs的靶向治療提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月—2013年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)蝶手術(shù)切除垂體瘤標(biāo)本120例。本研究中NFPAs的判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞無分泌激素功能或雖有分泌功能但不能檢測。FPAs的判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞具有分泌激素功能且能檢測到的垂體腺瘤，可分泌泌乳素、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、促甲狀腺激素、促性腺激素等。侵襲性垂體腺瘤判斷標(biāo)準(zhǔn)［1］：①采用Wilson的Hardy分類法將Ⅲ～Ⅳ級或C、D、E期的垂體腫瘤歸為侵襲性垂體腺瘤；②術(shù)前經(jīng)影像學(xué)檢查，CT及磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）可見海綿竇、鞍旁及下丘腦等鄰近結(jié)構(gòu)的破壞；③術(shù)中所取鞍底骨質(zhì)或鄰近硬腦膜經(jīng)病理學(xué)證實(shí)有腫瘤細(xì)胞侵犯；④術(shù)中可見鞍底骨質(zhì)及硬腦膜受侵襲破壞，腫瘤突入蝶竇腔或侵入鞍旁血管神經(jīng)。符合其中之一者即可確定為侵襲性垂體腺瘤；以上均需病理學(xué)證實(shí)，由病理學(xué)報(bào)告確診。所有標(biāo)本中符合侵襲性垂體瘤判斷標(biāo)準(zhǔn)60例，男性21例，女性39例，年齡18～70歲，平均（35.7±2.87）歲，其中 NFPAs為30例，F(xiàn)PAs為30例。非侵襲性垂體瘤60例，男性26例，女性34例，年齡24～73歲，平均（39.4±2.54）歲，其中NFPAs 30例，F(xiàn)PAs 30例。2組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 PI3K、mTOR的兔抗人多克隆抗體均購自武漢博士德公司；Akt的兔抗人多克隆抗體均購自美國Bioworld生物公司；山羊抗兔IgG免疫二抗購自武漢博士德公司；SP試劑盒購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司；DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判讀 手術(shù)時(shí)取所需組織用生理鹽水洗凈積血，用4%多聚甲醛（PBS 0.01 mmol／L，pH 7.0～7.6）進(jìn)行固定，石蠟包埋組織塊，切片厚度5μm，嚴(yán)格按照試劑盒說明的操作步驟行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果判斷：PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達(dá)主要是在細(xì)胞胞漿內(nèi)，2位病理醫(yī)師采用雙盲法在光鏡下隨機(jī)觀察8個(gè)高倍視野，記錄5個(gè)高倍視野（×400）中染色陽性的百分率，靶細(xì)胞染色陰性為0分，靶細(xì)胞陽性率1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；顯色度按切片中細(xì)胞顯色有無及染色深淺記分，細(xì)胞無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)雙評分半定量法進(jìn)行評分，將上述2項(xiàng)分相乘，分為4級：①陰性，為0分（-）；②弱陽性，為1～4分（＋）；③陽性，為5～8分（＋＋）；④強(qiáng)陽性，為9～12分（＋＋＋）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 侵襲性垂體瘤中NFPAs組與FPAs組PI3K、Akt、mTOR比較 侵襲性垂體瘤中NFPAs組PI3K和Akt的陽性表達(dá)率均高于FPAs組（P＜0.05）；mTOR陽性表達(dá)率在NFPAs組與FPAs組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 侵襲性垂體瘤中NFPAs組與FPAs組Pl3K、Akt、mTOR比較 （例數(shù)，%）

2.2 非侵襲性垂體瘤中NFPAs組與FPAs組PI3K、Akt、mTOR比較 非侵襲性垂體瘤中NFPAs組PI3K和Akt的陽性表達(dá)率均高于FPAs組（P＜0.05）；mTOR陽性表達(dá)率在NFPAs組與FPAs組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 非侵襲性垂體瘤中NFPAs組與FPAs組Pl3K、Akt、mTOR比較 （例數(shù)，%）

2.3 PI3K、Akt、mTOR在 NFPAs組與FPAs組中免疫組織化學(xué)結(jié)果 PI3K和Akt在侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體瘤中存在表達(dá)，但不管在侵襲性還是非侵襲性垂體瘤中，NFPAs組PI3K和Akt表達(dá)陽性率均高于FPAs組（圖1，2A～D）；mTOR在侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體瘤中存在表達(dá)，但不管是在侵襲性還是非侵襲性垂體瘤中，NFPAs組和FPAs組中mTOR表達(dá)陽性率差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，2E～F）。

圖1 侵襲性垂體瘤中Pl3K、Akt、mTOR在NFPAs組與FPAs組的免疫組織化學(xué)（×400）A.PI3K在侵襲性無功能腺瘤表達(dá)（＋＋＋）；B.PI3K在侵襲性功能腺瘤表達(dá)（＋＋）；C.Akt在侵襲性無功能腺瘤表達(dá)（＋＋＋）；D.Akt在侵襲性功能腺瘤表達(dá)（＋＋）；E.mTOR在侵襲性無功能腺瘤表達(dá)（＋＋＋）；F.mTOR在侵襲性功能腺瘤表達(dá)（＋＋＋）

圖2 非侵襲性垂體 瘤中Pl3K、Akt、mTOR在NFPAs組與FPAs組的免疫組織化學(xué)（ ×400）A.PI3K在非侵 襲性無功能腺瘤表達(dá) （＋＋）；B.PI3K在非侵襲性功能 腺瘤表達(dá)（＋）；C.Akt在非侵襲性 無功能腺瘤表達(dá)（＋＋）；D.Akt在 非侵襲性功能腺瘤表 達(dá)（＋）；E.mTOR在非侵襲性無功 能腺瘤表達(dá)（＋＋） ；F.mTOR在非 侵襲性功能腺瘤表達(dá)（＋＋）

3 討 論

PI3K／Akt／mTOR細(xì)胞傳導(dǎo)通路在各種侵襲性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如乳腺癌、胃癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、非小細(xì)胞性肺癌等［2-5］，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的促進(jìn)作用。且PI3K／Akt／mTOR細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在非侵襲性垂體瘤中同樣存在表達(dá)［1］。

PI3K／Akt屬于蛋白激酶偶聯(lián)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在各種生長因子（血小板轉(zhuǎn)化生成因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子等）作用下，與蛋白酪氨酸激酶受體結(jié)合，使其磷酸化，進(jìn)一步識別與PI3K上的p85調(diào)節(jié)亞基的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，解除p85亞基對催化亞基p110的抑制作用，使PI3K激活，活化的PI3K生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇［phosphatindylinositol（3，4，5）-trisphosphate，PIP3］，從而進(jìn)一步激活A(yù)kt。Akt是一種蛋白激酶，靜息狀態(tài)下位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，因?yàn)榕c蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋 白 激 酶 C（protein kinase C，PKC）有高度的同源性，又被稱為蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），它是PI3K信號通路下游重要的一個(gè)激酶。因?yàn)镻IP3含有與Akt相同的PH結(jié)構(gòu)域，兩者相互結(jié)合，將Akt由胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，同時(shí)使Akt的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露Thr308位點(diǎn)和Ser473位點(diǎn)，在PDK1、PDK2或整合素連接蛋白（integrin-linked kinase，ILK）參與下使 Thr308位點(diǎn)和Ser473兩位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而使Akt活化［6］。mTOR是一種非典型的絲氨酸／蘇氨酸激酶，由于其羧基末端與PI3K催化區(qū)高度同源，屬于PI3K的蛋白激酶家族。mTOR參與PI3K／Akt／mTOR細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，它是Akt的下游因子，活化的Akt直接或間接地激活mTOR，而活化的mTOR進(jìn)一步磷酸化它的2個(gè)下游分子，即翻譯抑制分子elF-4E結(jié)合蛋白1和核糖體蛋白p70s6k［6］，進(jìn)而滅活翻譯抑制蛋白和（或）增強(qiáng)細(xì)胞傳導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移。

PI3K／Akt／mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過對細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的調(diào)節(jié)，直接使pRb磷酸化失活，直接抑制p21，并通過泛素連接酶間接抑制p53活性，讓細(xì)胞周期不能滯留在G1期，加快有絲分裂的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，加快細(xì)胞的增殖，同樣也能通過對Bad、Caspase-9、Fas／FasL等凋亡因子的抑制作用，促進(jìn)腫瘤的生長。而PI3K／Akt／mTOR在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲方面有著重要的作用，可能主要依靠腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力增強(qiáng)、細(xì)胞間黏附能力的下降、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等［7］。

本研究中在侵襲性垂體腺瘤中，結(jié)果顯示PI3K和Akt在NFPAs組表達(dá)陽性率明顯高于FPAs組（P＜0.05），但mTOR在2組中的表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；非侵襲性垂體腺瘤中PI3K和Akt在NFPAs組表達(dá)陽性率明顯高于FPAs組（P＜0.05），但mTOR在2組中的表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

PI3K／Akt／mTOR信號通路的過度表達(dá)也在許多人類癌癥中被發(fā)現(xiàn)［8］，已經(jīng)證實(shí)，PI3K在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織，Akt在促進(jìn)垂體瘤產(chǎn)生及發(fā)展的過程中同樣起著重要的作用。在垂體腺瘤中Akt1和Akt2的mRNA表達(dá)明顯高于正常垂體，同時(shí)磷酸化Akt的免疫組織化學(xué)表達(dá)在垂體瘤中比正常垂體更高，在所有垂體腫瘤中，特別是在NFPAs，Akt是存在過度表達(dá)和過度活化的［8］，故Akt的高表達(dá)可以促進(jìn)NFPAs的生長，而相比較其在FPAs中的作用較微弱。mTOR的生物學(xué)功能是整合細(xì)胞外多種信號刺激，參與體內(nèi)多條信號通路，影響轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲和促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，在侵襲性和非侵襲性垂體瘤中，mTOR表達(dá)陽性率在NFPAs組和FPAs組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PI3K／Akt的高表達(dá)能夠促進(jìn)mTOR的表達(dá)升高，mTOR通過被PI3K／Akt信號途徑直接或間接激活，在眾多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中mTOR可以通過PI3K／Akt途徑對垂體瘤的生長起到促進(jìn)作用，尤其對NFPAs的生長、侵襲起到較明顯的促進(jìn)作用。

本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果提示NFPAs中PI3K、Akt、mTOR在侵襲性及非侵襲性垂體瘤中表達(dá)均高于FPAs組，但還需通過三者mRNA及蛋白表達(dá)水平的測定進(jìn)一步證明此結(jié)論。目前多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，PI3K／Akt／mTOR信號通路通過磷酸化下游分p70s6k及4E-BP1，下傳生存信號，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存。本研究還期待進(jìn)一步探討促進(jìn)mTOR活化的多種因素和機(jī)制及其下游因子是否同樣在NFPAs中存在活化或表達(dá)，期待為NFPAs的治療提供新的方向。

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