丙二醛引起草魚腸道、肝胰臟谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶通路抗氧化應(yīng)激

林秀秀 葉 元土 蔡春芳 吳 萍 黃 雨薇 陳 科全徐登輝 彭 侃 羅 其剛

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215123)

飼料油脂是水產(chǎn)動(dòng)物所必需的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)和能量物質(zhì)［1］。然而，其易發(fā)生氧化酸敗產(chǎn)生多種有害中間產(chǎn)物，會(huì)對(duì)魚體腸道［2］、肝胰臟［3-4］等內(nèi)臟器官產(chǎn)生重要影響。其中丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化次生產(chǎn)物中含量最為豐富的活性醛［5］，研究表明，MDA能與多種氨基酸或多肽作用，從而影響其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能［6］，且MDA對(duì)線粒體呼吸功能及相關(guān)脫氫酶具有不同程度的損傷作用［7］，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

還原型谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的小分子三肽，其能將體內(nèi)有害物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害物質(zhì)，并排出體外起到解毒作用，是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑［8］。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH的含量主要是通過谷胱甘肽還原酶(GSR)、谷胱甘肽合成酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶和部分谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)來調(diào)節(jié)的［9］，同時(shí)這些酶構(gòu)成了 GSH/GSTs通路。有研究表明，當(dāng)機(jī)體受到有害物質(zhì)侵害時(shí)，會(huì)引起GSH/GSTs通路相關(guān)酶發(fā)揮抗氧化防御作用［10-12］，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

本試驗(yàn)在飼料添加不同梯度MDA的條件下，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸道、肝胰臟的GSH/GSTs通路相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合腸道、肝胰臟和血清中MDA和GSH含量變化進(jìn)行綜合分析，旨在探討MDA對(duì)草魚腸道、肝胰臟GSH/GSTs通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

1.1.1 MDA 溶液的制備

制備原料為 1，1，3，3-四乙氧基丙烷(1，1，3，3-tetraethoxypropane)(Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，濃度≥96%)。制備方法:精確量取 1，1，3，3-四乙氧基丙烷 31.500 m L，用 95%乙醇溶解后定容至100 m L，攪拌 15 m in，此時(shí)每毫升溶液相當(dāng)于MDA 100 mg。MDA現(xiàn)配現(xiàn)用，不做保存。

1.1.2 飼料配制

以酪蛋白和秘魯蒸汽魚粉為主要蛋白質(zhì)源，豆油(“福臨門”牌1級(jí)大豆油)為主要脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料。以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組，然后在基礎(chǔ)飼料中分別添加 61(B1組)、124(B2組)和185 mg/kg(B3組)的MDA，配制3種試驗(yàn)飼料?；A(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。MDA的添加方式:依據(jù)每日的投喂量配制相應(yīng)體積的MDA溶液，均勻的噴灑在飼料中。飼料中MDA含量依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室飼料中氧化魚油對(duì)草魚生長(zhǎng)及肌肉脂肪酸組成的影響［13］試驗(yàn)中氧化魚油添加量對(duì)應(yīng)的MDA含量設(shè)定。

1.2 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)管理

草魚來源于浙江一星飼料有限公司養(yǎng)殖基地，為池塘培育的1冬齡魚種，共300尾，平均體重為(74.8±1.0)g。從中選擇 240 尾草魚，隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾。養(yǎng)殖試驗(yàn)在浙江一星飼料集團(tuán)試驗(yàn)基地進(jìn)行，在面積為3 335 m2(平均水深1.8 m)的池塘中設(shè)置網(wǎng)箱，網(wǎng)箱規(guī)格為 1.0 m×1.5 m×2.0 m。將各組草魚以重復(fù)為單位隨機(jī)分配在12個(gè)網(wǎng)箱中。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

各組草魚分別用商品料馴化1周后，開始正式投喂。每天08:00和15:00定時(shí)投喂，投飼率為體重的2%～4%。每10 d依據(jù)投飼量估算魚體增重并調(diào)整投喂率，記錄每天的投飼量。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)共72 d。

每周用試劑盒測(cè)定水質(zhì)1次，試驗(yàn)期間溶解氧濃度＞8.0 mg/L，pH 7.08～ 8.40，氨氮濃度＜0.2 mg/L，亞硝酸鹽濃度＜0.01 mg/L，硫化物濃度＜0.05 mg/L。試驗(yàn)期間養(yǎng)殖水溫25～33℃。

1.3 樣本采集與分析

1.3.1 基因樣本采集與分析

1.3.1.1 基因樣本采集

養(yǎng)殖72 d、停食24 h后，每網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾(每組共9尾)魚作為基因分析樣本。魚體表面經(jīng)75%酒精消毒，常規(guī)解剖，快速取出內(nèi)臟團(tuán)，在冰浴中剪取中腸的前1/4腸段以及部分肝胰臟，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗2～3次，各樣品一式二份，迅速裝于EP管中，液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆?。采樣所用剪刀鑷子均?jīng)滅酶滅菌處理。

1.3.1.2 引物設(shè)計(jì)

基因序列依據(jù)葉元土等［14］基因測(cè)序結(jié)果，qRT-PCR中谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)、谷胱甘肽還原酶(GSR)、pi-谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTpi)、微粒體谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶1(MGSt1)基因及內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)所使用的 Taqman引物由 Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見表2。

表2 定量PCR引物Table 2 Primers used in quantitative PCR

1.3.1.3 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

利用1.3.1.1所采集的單個(gè)網(wǎng)箱3尾草魚腸道與肝胰臟樣本，各取25 mg合并為1個(gè)樣本用于總RNA的提取，每組3個(gè)平行樣本(共9尾魚、3個(gè)測(cè)定樣本)。在樣本中加入液氮，研磨成粉末后，加入1 m L Trizol覆蓋粉末，待Trizol解凍成液體后全部轉(zhuǎn)移到1.5 m L的EP管中，按照Trizol方法提取總RNA。按照PrimeScriptTMRT Master M ix(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 定量分析

使用CFX96熒光定量PCR儀和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)熒光染料對(duì)草魚GSH/GSTs通路的相關(guān)基因(GCLC、GSR、GST-pi、MGST1)及內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為20μL:SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ10 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，滅菌水6μL。PCR反應(yīng)采用2步法，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s、95℃變性 5 s、60 ℃退火 30 s，共 40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行熔解曲線(melting curve)分析。

1.3.2 腸道、肝胰臟組織勻漿樣品制備與分析

每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)另取3尾魚，取部分腸段及肝胰臟，組織勻漿后，2 000 r/min離心15 m in，取上清液，用于GSH和MDA含量測(cè)定。GSH和MDA含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.3.3 血清樣品制備與分析

每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)另取10尾魚，以無(wú)菌1 m L注射器自尾柄靜脈采血，置于Eppendorf離心管中，室溫自然凝固 0.5 h后 3 000 r/m in冷凍離心10 min，取上清液分裝后，液氮速凍并于-80℃冰箱中保存。血清GSH和MDA含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為:

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間差異顯著性用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 腸道、肝胰臟、血清MDA含量

由表3可知，隨著飼料中MDA含量的增加，腸道MDA含量有上升的趨勢(shì)，且二者呈顯著的正相關(guān)(P＜0.05);然而，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組腸道MDA含量均無(wú)顯著變化(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，除B3組肝胰臟MDA含量顯著升高(P＜0.05)外，其余試驗(yàn)組均無(wú)顯著變化(P＞0.05)，但肝胰臟MDA含量與飼料MDA含量存在顯著的正相關(guān)(P＜0.05)。血清中MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

表3 腸道、肝胰臟和血清MDA含量及其與飼料MDA含量的相關(guān)性分析Table 3 The content of MDA in intestine，hepatopancreas and serum and its correlation analysis w ith dietary MDA content

2.2 腸道、肝胰臟、血清GSH含量

由表4可知，與對(duì)照組相比，腸道GSH含量除B2組外其余試驗(yàn)組均顯著升高(P＜0.05)。肝胰臟GSH含量各組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但隨飼料MDA含量升高有先上升后下降的趨勢(shì)。血清GSH含量隨飼料MDA含量升高呈下降趨勢(shì)，但各試驗(yàn)組均高于對(duì)照組，其中B1和B2組與對(duì)照組具有顯著差異(P＜0.05)。

表4 腸道、肝胰臟和血清GSH含量及其與飼料MDA含量的相關(guān)性分析Table 4 The content of GSH in intestine，hepatopancreas and serum and its correlation analysis w ith dietary MDA content

2.3 腸道、肝胰臟GSH合成相關(guān)基因表達(dá)量

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了草魚腸道、肝胰臟中GSH合成相關(guān)基因的表達(dá)量，分別包括GSH從頭合成途徑的關(guān)鍵基因GCLC以及參與還原途徑的GSR，結(jié)果如表5所示。

隨著飼料中MDA含量的增加，腸道GCLC表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)，且二者呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);相比對(duì)照組，B2和B3組腸道 GCLC表達(dá)量均顯著上調(diào)(P＜0.05)。隨著飼料中MDA含量的增加，肝胰臟GCLC表達(dá)量隨之下調(diào)，其中B3組顯著低于 B1 組(P＜0.05)。

除B2組腸道GSR表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)外，其余各組腸道和肝胰臟GSR表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，且GSR的表達(dá)量與飼料MDA含量的相關(guān)性較低。

表5 草魚腸道、肝胰臟中GCLC和GSR的表達(dá)量及其與飼料MDA含量的相關(guān)性分析Table 5 The expression levels of GCLC and GSR in intestine and hepatopancreas and their correlation analysis w ith dietary MDA content

2.4 腸道、肝胰臟GSTs基因表達(dá)量

采用qRT-PCR計(jì)算檢測(cè)了腸道、肝胰臟中GSTs基因表達(dá)量，分別包括胞液酶GSTpi以及膜結(jié)合酶MGST1，結(jié)果如表6所示。

相比對(duì)照組，B3和B2組腸道GSTpi和B3組腸道MGST1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)，且腸道GSTpi與MGST 1表達(dá)量與飼料MDA含量均呈顯著的正相關(guān)(P＜0.05)。

隨著飼料中MDA含量的增加，肝胰臟GSTpi表達(dá)量隨之上調(diào)，且二者呈顯著的正相關(guān)(P＜0.05)，其中 B3組相比對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，肝胰臟MGST1表達(dá)量均顯著下調(diào)(P＜0.05)。

表6 草魚腸道、肝胰臟GSTpi和MGST1表達(dá)量及其與飼料MDA含量的相關(guān)性分析Table 6 The expression levels of GSTpi and MGST1 in intestine and hepatopancreas and their correlation analysis w ith dietary MDA content

3 討 論

MDA通過血液系統(tǒng)進(jìn)入到體內(nèi)后，可能直接發(fā)揮作用，也可能通過促使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］，因此其對(duì)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)有重大影響，GSH/GSTs通路是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的重要組成，對(duì)維護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷具有重要意義。

3.1 MDA對(duì)草魚腸道、肝胰臟GSH合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

研究表明，肝胰臟與腸道具有相同的胚胎起源，所以在一定程度上保持著解剖和功能性聯(lián)系，肝胰臟血液供應(yīng)主要由門靜脈和肝動(dòng)脈提供，其中門靜脈的供血量占其全部供血的70%左右，且血液多數(shù)來自腸系膜上靜脈及腸系膜下靜脈，在這些靜脈血管中通常含有來自消化道產(chǎn)物［16］。本試驗(yàn)中，在飼料添加不同劑量的MDA，對(duì)草魚進(jìn)行為期72 d的投喂，通過檢測(cè)肝胰臟、腸道、血清中MDA含量，發(fā)現(xiàn)腸道MDA含量與飼料MDA含量呈正相關(guān)性，隨飼料MDA含量的增加而增加，但其增加的幅度較小，相比對(duì)照組均無(wú)顯著變化;而各試驗(yàn)組血清MDA含量相比對(duì)照組均顯著升高。有研究表明，MDA化學(xué)穩(wěn)定性和膜透過性均大于活性氧(ROS)［17］，且MDA的代謝途徑是由血液流向肝胰臟再由肝胰臟流向機(jī)體組織［18］，肝胰臟是MDA的主要代謝器官組織，飼料中的MDA大部分經(jīng)血液流向肝胰臟，因此腸道MDA含量變化較小而血液MDA含量變化較大。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCL)是合成GSH的限速酶，由GCLC和谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(GCLM)組成，GCLC含有γ-GCL底物結(jié)合位點(diǎn)和催化功能。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MDA刺激，腸道GCLC表達(dá)量相比對(duì)照組顯著上調(diào)，且隨飼料MDA含量的增加，GCLC表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)，且二者具有顯著相關(guān)性;然而，肝胰臟GCLC表達(dá)量隨飼料MDA含量的增加出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)。至少80%的MDA是與蛋白質(zhì)結(jié)合［19］，形成的 MDA-蛋白質(zhì)加合物，導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)功能發(fā)生紊亂，質(zhì)膜流動(dòng)性降低［20］，且該加合物會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)進(jìn)一步氧化應(yīng)激［21］。肝胰臟和腸道均受到MDA刺激的影響，而肝胰臟是MDA主要的代謝場(chǎng)所，其GCLC受到的刺激相比其他組織更加嚴(yán)重，因此表現(xiàn)出在MDA含量較低的B1組肝胰臟GCLC的表達(dá)量顯著上調(diào)而B2與B3組其表達(dá)量下調(diào)，而腸道從外界攝入的MDA相比于肝胰臟中的要少，腸道GCLC表達(dá)量均表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)，因此少量MDA刺激腸道會(huì)使腸道GCLC表達(dá)量上調(diào)，以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激。B3組肝胰臟MDA含量出現(xiàn)顯著增加的現(xiàn)象，這可能是肝胰臟GCLC表達(dá)量不斷下調(diào)，對(duì)魚體肝胰臟的保護(hù)作用減弱，致使肝胰臟受到了實(shí)質(zhì)性的損傷，從而導(dǎo)致MDA代謝作用減弱并在草魚肝胰臟中積累。肝胰臟是合成GSH的主要器官組織，且所合成的GSH大部分進(jìn)入血液后運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)器官組織當(dāng)中。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨飼料MDA含量的增加，肝胰臟中GSH含量無(wú)顯著變化，然而血清中GSH含量出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，這與GCLC在肝胰臟中的表達(dá)量變化一致。

GSR是體內(nèi)一種重要的抗氧化酶類，其主要的生理功能是利用還原型輔酶Ⅱ(NADPH)將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成GSH，從而為活性氧ROS的清除提供還原力，保護(hù)機(jī)體免受傷害［22］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除B2組腸道GSR表達(dá)量顯著升高外，各試驗(yàn)組的腸道和肝胰臟GSR表達(dá)量較對(duì)照組均無(wú)顯著差異，且與飼料MDA含量的相關(guān)性較低，這可能是由于MDA的作用方式是與蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)反應(yīng)破壞其結(jié)構(gòu)并生成有害物質(zhì)而并非直接導(dǎo)致體內(nèi)自由基的增加，因此GSH與自由基反應(yīng)形成GSSG的量較少，腸道和肝胰臟GSR的表達(dá)量并未受到顯著的影響。

3.2 MDA對(duì)草魚腸道、肝胰臟GSTs基因表達(dá)的影響

GSTs 是一個(gè)具有多種生理功能的基因家族，是由2個(gè)分子質(zhì)量為22～27 ku的多肽亞基組成的可溶性蛋白質(zhì)，其主要以同源二聚體的形式存在，少數(shù)以異源二聚體的形式存在［23］。GSTs催化GSH與親電子物質(zhì)發(fā)生軛合反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是降低GSH的酸度系數(shù)，一旦在活性中心形成硫醇基團(tuán)，它就能與距硫醇離子很近的H位點(diǎn)的親電子底物發(fā)生反應(yīng)［24］，除此之外，它還具過氧化物酶、脫氯化氫酶等的活性［25］。由于MDA能與多種氨基酸或多肽作用，這些作用可能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能或者破壞其空間構(gòu)象，且MDA形成的加合物會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)等造成二次損傷，在這個(gè)過程中會(huì)產(chǎn)生多種有害代謝產(chǎn)物，從而刺激GSTs在保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒素和致癌因子的損害發(fā)揮重要作用。

本試驗(yàn)涉及GSTs的2種同工酶，分別是胞液酶GSTpi和膜結(jié)合酶 M GST1。GSTpi是 G STs家族重要成員，由一個(gè)活躍的多態(tài)的基因編碼，可清除有害物質(zhì)，避免基因組的損傷［26］，也參加及調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥及分化反應(yīng)［27-28］，為此，GSTpi被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究表明，在正常生長(zhǎng)條件下，GSTpi以單體形式與c-Jun氨基末端激酶(JNK)形成復(fù)合物，抑制JNK活性，受到有害物質(zhì)如MDA等刺激后，GSTpi自身形成二聚體，致使復(fù)合物解離，JNK磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun，促進(jìn)GSTpi轉(zhuǎn)錄，增加其含量，其又能反饋抑制JNK，維持 JNK的低活性［29］，從而大大降低細(xì)胞因受外界刺激而造成的損傷。MDA能與細(xì)胞中蛋白質(zhì)、氨基酸、DNA形成相應(yīng)的加合物，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且MDA還能與信號(hào)蛋白作用，在肝星狀細(xì)胞(HSCs)中誘導(dǎo)尿激酶型纖溶酶原激活劑分泌增加，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展［30］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MDA刺激后，GSTpi的表達(dá)量在肝胰臟和腸道均有所上調(diào)，且在B3組均達(dá)到最大值。這可能是由于MDA導(dǎo)致細(xì)胞損傷，使GSTpi表達(dá)量上調(diào)，加快清除體內(nèi)有害物質(zhì)且在一定程度上抑制了細(xì)胞的凋亡。由于MDA主要的代謝部位是肝胰臟，對(duì)肝胰臟的損傷作用相對(duì)于腸道會(huì)更嚴(yán)重，因此本研究發(fā)現(xiàn)在受到MDA刺激后，肝胰臟GSTpi的表達(dá)量高于腸道。

MGST1是一個(gè)分子質(zhì)量大約為17 ku的膜結(jié)合 GSTs［31］。相比胞液 GSTs，MGST1 具有 1 個(gè)特殊的Cys49結(jié)構(gòu)，有害物質(zhì)能夠修飾Cys49基團(tuán)，這些修飾包括烷基化、形成二硫鍵(或者混合二硫化物與GSH或蛋白質(zhì)二聚體)，或次磺酸修飾，誘導(dǎo)其構(gòu)象變化和增加活性［32-33］。本研究發(fā)現(xiàn)，MDA刺激下，腸道中MGST1表達(dá)量上調(diào)，而肝胰臟中MGST1表達(dá)量則下調(diào)。這可能是由于MDA與細(xì)胞膜作用，促使其脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生各種有害物質(zhì)刺激腸道細(xì)胞MGST1表達(dá)量上調(diào)，MGST1活性增加以加強(qiáng)催化GSH與有害物質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害物質(zhì)并排出體外，起到保護(hù)腸道細(xì)胞免受進(jìn)一步損傷的作用。MGST1主要存在于肝胰臟線粒體的內(nèi)外膜上，而在其他組織中含量較少［34］，過量的MGST1會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPT)的形成，有害物質(zhì)進(jìn)入線粒體當(dāng)中，使線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死［35］，因此，在肝細(xì)胞中適當(dāng)減少M(fèi)GST1的表達(dá)也是對(duì)細(xì)胞的一種保護(hù)作用。

將腸道與肝胰臟中2種同工酶與飼料MDA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除肝胰臟MGST1的表達(dá)量與飼料MDA含量相關(guān)性較低外，其余均顯著相關(guān)，這進(jìn)一步證明了上述的解釋，即草魚肝胰臟MGST1在受到MDA刺激后，表現(xiàn)出兩面性:一方面，MGST1催化GSH與有害物質(zhì)反應(yīng)起到解毒的作用;另一方面，過多的MGST1會(huì)對(duì)肝細(xì)胞的線粒體造成損傷，其整體表現(xiàn)出的表達(dá)量與飼料MDA含量顯示較低的相關(guān)性，同時(shí)，因GSTpi的性質(zhì)，使得腸道、肝胰臟GSTpi的表達(dá)量與飼料MDA含量呈顯著正相關(guān);而MGST1在腸道的表達(dá)量比肝胰臟少，還未表現(xiàn)出過多的MGST1所造成損傷作用的一面，因此也與飼料MDA含量呈顯著正相關(guān)。

4 結(jié)論

飼喂不同含量MDA的飼料72 d后，MDA誘導(dǎo)腸道GSH/GSTs通路相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，且腸道GSH含量也有所上升，表明MDA引起了草魚腸道的抗氧化應(yīng)激。飼喂低含量MDA(61 mg/kg)飼料后草魚肝胰臟GCLC表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)，而MDA含量超過124 mg/kg時(shí)則表現(xiàn)為下調(diào)，這表明MDA引起了草魚肝胰臟的抗氧化應(yīng)激，并隨MDA含量升高其抗氧化應(yīng)激能力出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。草魚腸道和肝胰臟中MGST1表達(dá)量出現(xiàn)了完全不同的趨勢(shì)，這表明草魚腸道和肝胰臟受MDA的影響程度有一定的差異。

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