甜菜堿對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數的影響

田 雨 楊 榛 韓兆玉*

(1.南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司，南京 210014;2.南京農業(yè)大學動物科技學院，南京 210095)

甜菜堿廣泛存在于動植物體內，分子結構比較簡單，與蛋氨酸、膽堿的化學結構相似，都屬季胺堿類物質，是甲基的高效供體，具有抗氧化，調節(jié)滲透壓，調控動物體內生長調控因子的水平等作用［1］。甜菜堿作為飼料添加劑已經廣泛使用于豬禽等單胃動物，研究表明，甜菜堿可以緩解斷奶仔豬應激，降低腹瀉率，提高瘦肉率［2］，郭建鳳等［3］表明商品瘦肉豬飼糧添加甜菜堿可以顯著提高生長速度和飼料報酬;而甜菜堿替代部分蛋氨酸應用于肉雞生產中，可以降低飼料成本［4］;在水產動物中，張陽軍［5］研究表明，添加甜菜堿對羅氏沼蝦是很好的誘食劑，并在提高生產性能方面有很好的作用。然而，反芻動物具有復雜的瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)，甜菜堿在反芻動物的應用中表明，可以提高生產性能［6］，并在一定程度上可以緩解隱性乳房炎［7］。張麗等［8］研究表明飼糧中添加甜菜堿可以提高奶牛生產性能，降低奶牛外周血中熱應激蛋白70(HSP70)含量，緩解奶牛熱應激。連紅等［9］研究發(fā)現復合包膜甜菜堿的添加有積累血漿中總氮的趨勢，其中白蛋白和總蛋白含量顯著升高，而尿素氮含量顯著降低。反芻動物對飼料的消化實際就是瘤胃中的微生物對飼料進行發(fā)酵，飼料利用率的高低很大程度上取決于瘤胃發(fā)酵的程度。本試驗將通過添加不同水平的甜菜堿于體外發(fā)酵的瘤胃液中，探討甜菜堿對奶牛瘤胃發(fā)酵參數的影響，為甜菜堿在奶牛上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)酵底物:江蘇省南京市某奶牛場精粗比為50 ∶50，干物質(DM)含量為 54.60%，粗蛋白質(CP)含量為17.15%，中性洗滌纖維(NDF)含量為34.72%的全混合日糧(TMR)經烘干粉碎過1目篩，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

甜菜堿:由江蘇宜興天石飼料有限公司提供，性狀為白色均勻圓形顆粒，不溶于水，易溶于有機溶劑，純度為40%。

1.2 試驗設計

本試驗采用單因素試驗設計，試驗分為3組，分別為對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組，均以300 mg TMR作為發(fā)酵底物，添加到45 m L人工瘤胃發(fā)酵液中，各組分別添加 0、1.2、3.6 mg 甜菜堿(純度為40%)。

1.3 試驗儀器設備

玻璃培養(yǎng)管:本試驗的產氣裝置為100 m L注射器。

在試驗之前，進行注射器的前處理及選擇工作。首先將注射器的活塞拔出涂抹凡士林，以增加潤滑度，減少摩擦，而后在同樣量的底物、瘤胃液和培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)一定時間，通過產氣量選擇出合適的注射器，以此來消除活塞重量不同及其與注射器管壁間的摩擦力的不同造成的誤差。產氣量的測定是通過發(fā)酵產生的氣體將活塞頂起的高度，直接從注射器刻度讀出。

人工瘤胃培養(yǎng)箱:由恒溫水浴振蕩器改裝成為水浴恒溫培養(yǎng)箱，溫度、振蕩速度可調。

CO2氣罐及氣體:采用純度為99.999%的CO2氣體作為厭氧條件產生和維持的氣源。

恒溫培養(yǎng)箱:作為預熱玻璃培養(yǎng)管的裝置，試驗前應將玻璃培養(yǎng)管在預熱狀態(tài)下涂抹適量的凡士林，待加樣后將培養(yǎng)管在已調試好的39℃培養(yǎng)箱中預熱。

恒溫水浴鍋:用于采集瘤胃液時的保溫。

恒溫及磁力攪拌裝置:恒溫水溫箱用于培養(yǎng)管在分液過程中提供緩沖環(huán)境并保證培養(yǎng)液的溫度保持39℃。磁力攪拌器用于保證培養(yǎng)液的恒溫及混合均勻。

表1 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the TMR(DM basis) %

醫(yī)用紗布和漏斗:采用標準的醫(yī)用紗布用于瘤胃液的過濾，采用瓷制漏斗用于瘤胃液內容物的過濾。

分析天平:用于培養(yǎng)底物的稱量。

1.4 人工瘤胃發(fā)酵液的制備

采用Menke等［11］的方法準備瘤胃發(fā)酵液，人工瘤胃發(fā)酵液由常量元素溶液(A液)、微量元素溶液(B液)、緩沖液(C液)、指示劑溶液、還原劑溶液配成。各種溶液的配方見表2。將1 000 m L的分液瓶放入39℃水浴中，用磁力攪拌器攪拌，按以下比例和順序配制:蒸餾水400 m L+B液0.1 m L+A液200 m L+C液200 m L+刃天青溶液1 m L+還原劑溶液40 m L。加入刃天青溶液后混合液變?yōu)榧t色，通入無氧CO2并預熱至39℃后約30 min，混合液顏色變淡或無色(在與過濾瘤胃液混合之前加入還原劑并通CO2氣體至溶液褪至完全無色即可用，且用前新鮮配制，再通 CO2至飽和)。

表2 人工瘤胃發(fā)酵液單一溶液配方Table 2 Formula of single solution in artificial rumen fermentation fluid

屠宰場選擇2頭健康奶牛屠殺，打開瘤胃后均勻采樣，經4層紗布過濾瘤胃內容物至預熱至(39.00±0.25)℃的容器中，迅速帶回實驗室，將瘤胃液與人工瘤胃發(fā)酵液以1∶2的體積比混合，制成混合人工瘤胃發(fā)酵液。混合人工瘤胃發(fā)酵液邊加熱邊用磁力攪拌器攪拌，同時通入CO2。

1.5 分裝和培養(yǎng)

準確稱取300 mg發(fā)酵飼料及相應量的反芻動物專用甜菜堿(對照組不添加，試驗Ⅰ組添加1.2 mg，試驗Ⅱ組添加3.6 mg)送入100 m L玻璃注射器內，用自制加液器向每個培養(yǎng)管(注射器)中分別加入(45±1)m L人工瘤胃發(fā)酵液。在注射器活塞前1/3部位均勻涂抹適量醫(yī)用凡士林，39℃培養(yǎng)。為了保證測試樣品具有代表性，每個樣本設4個平行。

1.6 讀取產氣量

當培養(yǎng)至 3、6、12、18、24 h 時，取出培養(yǎng)管，快速讀取活塞所處的刻度值(m L)并記錄。若某一時間點讀數超過80 m L時，為了防止氣體超過刻度而無法讀數，應在讀數后及時排氣并記錄排氣后的刻度值。

1.7 終止發(fā)酵

待培養(yǎng)管在體外培養(yǎng)6、12、24 h后，將各組其中4個培養(yǎng)管分別取出放入冰水浴中使發(fā)酵停止。將培養(yǎng)管中的發(fā)酵液排出至已知重量的50 m L塑料離心管，立即用pH計測定發(fā)酵液pH。發(fā)酵液經離心(1 500 r/min)15 m in，取上清液分管冷凍保存以備測定發(fā)酵液的菌體蛋白、乳酸、氨氮(NH3-N)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量。同時洗滌培養(yǎng)管中的殘渣并將其與對應樣品離心所得沉淀一起用蒸餾水懸浮，再離心，重復2次后在65℃烘干48 h，稱重并根據差量法計算樣品干物質降解率。

1.8 測定指標及方法

1.8.1 測定指標

分別在發(fā)酵3、6、12、18和24 h測定各培養(yǎng)瓶的產氣量;在6、12、24 h測定pH，干物質降解率，NH3-N、VFA、乳酸和菌體蛋白含量。

1.8.2 測定方法

產氣量=某時間段產氣量－對應時間段空白管產氣量;采用HANNAHI221型臺式酸度計測定發(fā)酵液的pH;干物質降解率采用烘干減質量法測定;NH3-N含量采用馮宗慈改進的比色法測定［12］;VFA 含量參照胡偉蓮［13］氣相色譜內標法，采用日本島津GC－14B型氣相色譜儀測定;乳酸含量的測定參照Barker等［14］方法;菌體蛋白含量測定參照文獻［15－16］測定，Low ry試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.9 數據處理與統(tǒng)計分析

試驗數據經Excel 2013初步整理后，用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。試驗各組之間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用最小顯著差數(LSD)法，結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 體外發(fā)酵產氣量

由表3可知，在各時間點試驗組的產氣量均高于對照組，其中試驗Ⅱ組在3和6 h顯著高于對照組(P＜0.05)，其余時間點組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 發(fā)酵液 pH、干物質降解率及菌體蛋白、乳酸和NH 3含量

由表4可知，各組在各發(fā)酵時刻的pH均處于正常范圍(6～7)，由于發(fā)酵產物的積累發(fā)酵液的pH逐漸減小，在6 h試驗Ⅱ組顯著低于對照組和試驗Ⅰ組(P＜0.05)，其余時間點差異不顯著(P＞0.05)，但均低于對照組和試驗Ⅰ組;試驗組的干物質降解率和菌體蛋白含量均比對照組高，其中在6 h達到顯著水平(P＜0.05);試驗組NH3-N含量在6 h均低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)，試驗Ⅰ組NH3-N含量在12 h極顯著高于對照組(P＜0.01)，24 h高于對照組，差異不顯著(P＞0.05)，試驗Ⅱ組 NH3-N含量在12 h極顯著高于對照組(P＜0.01)，24 h顯著高于對照組(P＜0.05);試驗組之間以及與對照組相比，乳酸含量無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 甜菜堿對體外發(fā)酵產氣量的影響Table 3 Effects of betaine on gas production of in vitro fermentation m L

表4 甜菜堿對發(fā)酵液pH、干物質降解率、菌體蛋白、乳酸和氨氮含量的影響Table 4 Effects of betaine on pH，DMD and bacteria protein，lactic acid and NH3-N contents of fermentation fluid

續(xù)表4

2.3 發(fā)酵液VFA含量

由表5可知，試驗組發(fā)酵液中的VFA含量較對照組總體呈增加趨勢。在6 h試驗Ⅱ組的丁酸含量顯著高于對照組(P＜0.05);與對照組相比，在12 h試驗組的異丁酸含量極顯著高于對照組(P＜0.01)，異戊酸含量顯著高于對照組(P＜0.05)，試驗Ⅰ組戊酸含量極顯著高于對照組(P＜0.01)，試驗Ⅱ組顯著高于對照組(P＜0.05)，試驗組乙酸/丙酸極顯著高于對照組(P＜0.01);24 h試驗組與對照組相比，各VFA含量無顯著差異(P＞0.05)。

表5 甜菜堿對發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 5 Effects of betaine on VFA contents of fermentation fluid

3 討 論

近年來研究發(fā)現甜菜堿可為機體高效提供活性甲基，參與蛋白質與脂類代謝，有調節(jié)滲透壓，緩解應激，促進采食等生理過程，但關于甜菜堿在反芻動物上的應用較少，其具體降解機理和作用機制還有待于進一步研究和證實。

相對穩(wěn)定的瘤胃內環(huán)境是瘤胃微生物發(fā)揮正常功能的重要條件，pH過低對于瘤胃微生物正常生長、發(fā)育及發(fā)酵有不利的影響。本試驗結果表明隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵產物的不斷積累，各組pH均呈下降的趨勢，而試驗組較對照組下降快。但總體來講pH的變化范圍未超出瘤胃微生物的最適生長范圍［12］，對瘤胃發(fā)酵沒有產生不利影響。

瘤胃液中的氨氮是瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質和內源含氮物質降解的重要產物，它同時也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料。其含量是瘤胃內環(huán)境參數的一個重要指標，它反映了瘤胃內微生物氮的供應狀況。一般情況下，瘤胃液NH3-N含量處于動態(tài)平衡狀況，但其含量常受氮進食量、飼糧蛋白質降解度、瘤胃微生物合成速度以及瘤胃對NH3-N的吸收等因素的影響。通常情況下，如果含氮物質供應不足，則微生物生成受阻，降低動物的生產性能;而含氮物質過量，則會在瘤胃內降解產生大量不能被微生物充分利用的氨，會造成大量氨從瘤胃中吸收進入血液，最后經肝臟處理產生尿素由尿中排出，一方面造成氮源的浪費，另一方面會造成動物氨中毒。菌體蛋白是瘤胃微生物經復雜的發(fā)酵過程合成的，菌體蛋白是反芻動物最主要的氮源供應者，它可以滿足動物營養(yǎng)需要量的40%～80%。本試驗中，試驗組的NH3-N和菌體蛋白含量有升高的趨勢，說明甜菜堿可以促進瘤胃發(fā)酵NH3-N的產生，進而為菌體蛋白的合成提供足夠的氮源，促進了菌體蛋白的產生。

反芻動物的最為突出的營養(yǎng)生理特點——瘤胃發(fā)酵是指瘤胃微生物在一定程度上將飼料的碳水化合物發(fā)酵產生VFA，將飼料的含氮化合物降解為氨［17］，瘤胃發(fā)酵產生的VFA是反芻動物賴以生存、保持正常生長、泌乳繁殖的主要能源，可提供反芻動物總能量需要的70%～80%［18］。通過瘤胃發(fā)酵不僅使反芻動物大量利用單胃動物和人類所不能充分利用的纖維物質，提高VFA的含量，而且使利用低質蛋白質飼料成為可能。VFA是碳水化合物在瘤胃內經多種微生物發(fā)酵的主要產物，它提供的能量幾乎占反芻動物所吸收利用的營養(yǎng)物質總能的2/3，VFA的變化是反映乳脂率、瘤胃發(fā)酵、瘤胃消化代謝的重要指標。通常，非結構性碳水化合物(NSC)發(fā)酵的產物中丙酸的比例較高，而纖維類物質發(fā)酵以產乙酸為主［19］。本試驗發(fā)現，隨著發(fā)酵時間的延長，試驗組的VFA含量比對照組高，而VFA含量與pH呈反相關，試驗中試驗組pH的降低間接反映VFA含量的增加。甜菜堿是天然甲基供體，純甜菜堿供甲基的效率是50%分別是膽堿和DL－蛋氨酸的2.3～4.2倍和1.5～3.3倍。早期體內和體外研究表明甜菜堿被瘤胃微生物代謝為乙酸和三甲胺［20］，但甜菜堿在瘤胃內的降解受到試驗條件和飼糧類型的影響，本研究發(fā)現添加甜菜堿可以提高奶牛瘤胃體外發(fā)酵VFA含量。

產氣量和干物質降解率的多少，反映飼料的利用情況，本試驗發(fā)現試驗組產氣量和干物質降解率都顯著提高，而添加甜菜堿可以促進飼料在瘤胃的消化，進而提高飼料利用率。

乳酸是瘤胃發(fā)酵的中間產物，乳酸的及時清除對防止瘤胃酸中毒有重要意義。在瘤胃發(fā)酵過程中，乳酸不斷轉化為VFA，進而為動物利用，有研究報道，瘤胃液乳酸含量與VFA含量、纖維素降解率成反比［21］。本試驗發(fā)現，各組乳酸含量差距不大，說明添加甜菜堿對瘤胃發(fā)酵的乳酸產生沒有影響。

4 結論

添加1.2和3.6 mg的甜菜堿可以降低體外瘤胃發(fā)酵pH，提高產氣量，干物質降解率，NH3-N、菌體蛋白、VFA含量，并呈現劑量依賴性，且在發(fā)酵6 h時最為明顯。

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