湖羊小腸黏膜內(nèi)參基因篩選

馬志遠 翁秀秀 李 飛* 李發(fā)弟，2 王維民 劉 婷

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州 730020;2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實驗室，民勤 733300;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，蘭州 730070)

實時定量PCR(RT-PCR)是繼Northern印跡雜交、原位雜交和RNA保護酶技術(shù)之后發(fā)展起來的一種新的mRNA表達定量方法，與之前的技術(shù)相比具有準確、高效、重復(fù)性好等特點。在相對定量中選取表達穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參基因，可以校正不同樣品因RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率的差異而造成的定量結(jié)果差異［1］。但是，常見的內(nèi)參基因在不同的組織和不同生理狀態(tài)下表達并不穩(wěn)定［2-3］，如沒有針對試驗要求進行內(nèi)參基因的穩(wěn)定性檢驗，目的基因的表達有可能被錯估。

近年來，利用相對定量方法研究黏膜免疫及轉(zhuǎn)運功能的文章發(fā)表較多(表1)［4-10］。由表1可知，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶 1(PGK1)、18S rRNA和 β-肌動蛋白(ACTB)基因是研究胃腸道黏膜常用的內(nèi)參基因，但是尚未有文獻報道這些內(nèi)參在湖羊小腸黏膜內(nèi)表達是否穩(wěn)定，有待研究。

小腸黏膜具有營養(yǎng)物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運及免疫屏障等功能［11］，研究腸黏膜有助于了解營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運、腸道功能及腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持過程。生產(chǎn)中，羔羊一般在42和84日齡進行飼糧過渡(由母乳或代乳料向開食料過渡，由開食料向育肥料過渡)，營養(yǎng)素是影響腸道發(fā)育與功能建立的關(guān)鍵因素，導(dǎo)致小腸黏膜形態(tài)、結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運功能在該時間點變化較大［12］，但該階段穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因有哪些尚不清楚。因此，本試驗利用RT-PCR法，檢測候選內(nèi)參基因 GAPDH、PGK1、18S rRNA和ACTB在42和84日齡湖羊公羔小腸黏膜中表達穩(wěn)定性，篩選出適用于湖羊小腸黏膜RT-RCR內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用金昌中天羊業(yè)純種湖羊公羔6只隨母補飼，7日齡開始補飼開食料，56日齡斷奶，繼續(xù)飼喂開食料至60日齡逐漸更換生長料，過渡期10 d。分別于42和84日齡頸靜脈放血各屠宰3只，解剖腹部后棉線結(jié)扎分離十二指腸、空腸、回腸，去除食糜后用載玻片刮取各小腸腸段黏膜，迅速置于液氮冷凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 黏膜基因相對定量常用內(nèi)參基因Table 1 Common reference genes used in relative quantification ofmucosal genes

試驗中所用到的儀器有Nanodrop核酸分析儀(Thermo，美國)，F(xiàn)lexCycler2 PCR 儀(Biometra，德國)，Bio-Rad CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad，美國)。

試驗中所用到的試劑藥品TriZol試劑盒(TransZol)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperM ix)以及定量試劑盒(TransStart Top Green qPCR Super-M ix)均由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈合成

將小腸黏膜樣于研缽內(nèi)加液氮磨碎后，取粉樣 0.10 g，加入 1 m L TransZol顛倒混勻，室溫靜置5 m in，加入200μm氯仿顛倒混勻，靜置3 m in，4℃離心(10 000×g)10 m in，取上清液500μL于新離心管內(nèi)，加入預(yù)冷異丙醇500μL，靜置10 m in后4℃離心(1 000×g)，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀后，加 60μL 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。所得RNA樣品利用Nanodrop核酸分析儀測定OD260nm/OD280nm檢測RNA純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測18S與28S條帶清晰，無雜質(zhì)污染。

cDNA第1條鏈按照TransScript one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperM ix說明合成，反應(yīng)體系為:模板 1 μL，Oligo(d)T 1 μL，gDNA Remover 1 μL，2×TS Reaction M ix 10 μL，無RNA酶水補足20μL。FlexCycler2 PCR儀反應(yīng)條件為:42℃持續(xù)30 m in，85℃持續(xù)5 m in。反應(yīng)結(jié)束后利用GAPDH引物擴增，反應(yīng)體系為:模板1 μL，上、下游引物各 0.8 μL，Superm ix 12.5 μL，ddH2O補足25μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃ 變性 15 s，56 ℃ 退火 20 s，72℃ 延伸15 s，25個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段清晰，無雜質(zhì)污染，表明樣品反轉(zhuǎn)成功。cDNA樣按照OD計算稀釋至同一濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選管家基因及引物設(shè)計

候選基因 GAPDH、PGK1、18S rRNA、ACTB引物通過Primer 6.0軟件設(shè)計。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段特異性好，無引物二聚體(圖1)。引物由上海生工合成，信息見表2。

圖1 候選管家基因引物特異性擴增Fig.1 The specific amplification of candidate housekeeping gene primers

表2 候選管家基因引物信息Table 2 Primer information of candidate housekeeping genes

1.4 RT-PCR

RT-PCR在Bio-Rad CFX96TMReal-Time System進行。反應(yīng)體系按TransStart Top Green qPCR SuperM ix說明進行，反應(yīng)體系為:模板1μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperM ix 10 μL，上、下游引物各0.4μL，ddH2O 補足 20μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性15 s，63℃退火20 s，72 ℃延伸 15 s，41個循環(huán)。從 56～95 ℃，每循環(huán)增加0.5℃，持續(xù)0.05 s獲得解鏈溫度，采集熔解曲線熒光信號。

1.5 標(biāo)準曲線的繪制和引物擴增效率驗證

將稀釋至相同濃度的cDNA模板按1、1/5、1/25、1/125、1/625倍連續(xù)稀釋 5個梯度，每個梯度3個技術(shù)重復(fù)，利用CFX ManagerTMSoftware分析計算相關(guān)系數(shù)、斜率、擴增效率，詳見表3。

引物擴增效率計算方程式如下:

擴增效率=10-(1/斜率)-1。

表3 候選管家基因標(biāo)準曲線相關(guān)系數(shù)、斜率、擴增效率Table 3 R2，slope and amplification efficiency of standard curves of candidate housekeeping genes

1.6 數(shù)據(jù)分析

候選管家基因表達的穩(wěn)定性利用ΔCt法［13］、geNorm 軟件［14］、BestKeeper軟件［15］進行分析和評價。

2 結(jié) 果

2.1 不同小腸腸段和日齡Ct的比較

Ct越小，基因的表達豐度越高，反之，基因表達豐度越低。由圖2和圖3可知，18S rRNA的表達豐度是4個候選基因中最高的，GAPDH和ACTB較低，PGK1居中。在不同的小腸腸段黏膜中，PGK1和ACTB表達較為穩(wěn)定，不同日齡4個候選基因的表達都較穩(wěn)定，以ACTB為最。

2.2 geNorm 軟件、ΔCt法分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

由表4可知，geNorm軟件M值得出穩(wěn)定性排名為 ACTB=PGK1＞GAPDH＞18S rRNA，ΔCt法得出排名為 ACTB＞PGK1＞18S rRNA＞GAPDH、平均標(biāo)準差排名為 ACTB＞18S rRNA＞PGK1＞GAPDH。

圖2 候選管家基因在不同小腸腸段的黏膜中Ct的比較Fig.2 Comparison of Ct of candidatemucosal housekeeping genes in small intestinal tract compartments

圖3 候選管家基因在不同日齡的小腸黏膜中Ct比較Fig.3 Comparison of Ct of candidatemucosal housekeeping genes in small intestine at different days of age

表4 geNorm軟件、ΔCt法分析候選管家基因穩(wěn)定性排序Table 4 Stability ranking of the candidate housekeeping genes by geNorm software andΔCtmethod

2.3 BestKeeper軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

由表5可知，根據(jù)變異系數(shù)可以看出，Best-Keeper軟件分析內(nèi)參表達穩(wěn)定性排序為PGK1=ACTB＞18S rRNA＞GAPDH。

3 討論

在腸隱窩中存在大量多功能干細胞保證腸黏膜細胞快速持續(xù)更新，新生腸上皮細胞在向絨毛層遷移的過程中逐漸分化成熟，最終死亡脫落進入消化管內(nèi)［11］。針對隱窩干細胞及黏膜功能細胞的研究有助于腸道疾病的治療及腸道功能機理的揭示，目前大量腸道分子機理研究都應(yīng)用了RTPCR技術(shù)［4-10］，涉及到黏膜這類含多種組織的器官時，選擇表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

表5 BestKeeper軟件分析候選管家基因穩(wěn)定性(表達豐度交叉點)Table 5 Stability of candidate housekeeping genes by BestKeeper software(cross points of expression level)

目前用于篩選內(nèi)參基因常用的軟件有g(shù)eNorm軟件、BestKeeper軟件以及ΔCt法等。geNorm軟件錄入的數(shù)據(jù)為相對表達豐度(2-ΔCt，ΔCt為每個基因不同樣本Ct與其中最小Ct之差)，M值是單個內(nèi)參基因與其他內(nèi)參基因表達豐度的兩兩比值后的對數(shù)變換從而計算出的平均標(biāo)準差，M值越小穩(wěn)定性越好;BestKeeper軟件計算得出表達豐度交叉點(CP)的平均值、最大值、最小值、標(biāo)準差及變異系數(shù)，CP的標(biāo)準差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定，反之越不穩(wěn)定。此外BestKeeper軟件還可以錄入目標(biāo)基因的Ct數(shù)據(jù)，對內(nèi)參基因和目標(biāo)基因進行單獨分析;ΔCt法通過計算各內(nèi)參之間的平均標(biāo)準差，對內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性進行排序，標(biāo)準差越小穩(wěn)定性越好。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同類型細胞中穩(wěn)定表達，且不受內(nèi)外源因素影響，常見的內(nèi)參基因在不同的試驗條件下表達穩(wěn)定性差異較大［16-17］，本試驗中發(fā)現(xiàn)4種候選基因在小腸各段間以及不同時間點上的表達穩(wěn)定性存在差異，3種方法計算的候選基因穩(wěn)定性排名各不相同，但ACTB排名均靠前。

GAPDH和PGK1是糖酵解及糖異生過程中的關(guān)鍵酶基因，是常見的內(nèi)參基因，但是，在特殊條件下作為內(nèi)參存在缺陷。黏膜細胞供能主要依靠谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)氧化［18-19］，本試驗中GAPDH在不同腸段內(nèi)表達豐度并不穩(wěn)定，3種內(nèi)參穩(wěn)定性分析法得出GAPDH穩(wěn)定性排名均較次可能與此有關(guān)。PGK1在本試驗中表達較穩(wěn)定，但是該基因在胰腺導(dǎo)管腺癌［20］、結(jié)腸癌［21］等多種癌變細胞中表達豐度升高，且該基因在腸道炎癥病變條件下表達不穩(wěn)定［22］。

18S rRNA合成調(diào)節(jié)獨立于mRNA，一般情況下其表達豐度較穩(wěn)定，但是在有絲分裂時期，18S rRNA 表達豐度會降低［23］。本試驗中，42～84日齡是小腸快速發(fā)育時期，其在不同腸段上表達存在較大差異，可能與發(fā)育過程中有絲分裂強弱有關(guān)。此外，18S rRNA的表達豐度高，Ct較低，與目標(biāo)基因的 ΔCt較大，也是其作為內(nèi)參基因的缺陷［2］。

ACTB是組成細胞的骨架蛋白，在真核細胞中表達穩(wěn)定［24］，但是也有報道指出，其在成纖維細胞［25］，仔豬的心臟、肝臟、脾臟［26］，山羊的肝臟、皮下脂肪和背最長肌中表達穩(wěn)定性較差［27］。在本試驗中，ACTB在各腸段各時間點上表達最穩(wěn)定，在3種不同分析方法下排名也最穩(wěn)定。董曉麗等［28］通過篩選幼齡小鼠腸道內(nèi)參后發(fā)現(xiàn)，幼齡小鼠小腸發(fā)育過程中，ACTB的穩(wěn)定性高于GAPDH，這與本試驗結(jié)果相同。

本試驗羔羊均從56日齡斷奶，7日齡開始補飼開食料，60日齡逐漸更換生長料，內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性是否與斷奶日齡及飼糧有關(guān)有待進一步研究;本試驗僅選取28和84日齡湖羊羔羊小腸黏膜樣品檢驗內(nèi)參表達穩(wěn)定性，ACTB是否適用于湖羊整個生理階段有待證明。

4 結(jié)論

綜上，利用RT-PCR研究湖羊小腸黏膜的內(nèi)參基因最佳選擇為ACTB，其次為PGK1。18S rRNA和GAPDH表達的穩(wěn)定性較差，不適宜作為小腸黏膜研究內(nèi)參基因。

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