原代人子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離及培養(yǎng)鑒定＊

劉 妍，李衛(wèi)紅△，韋尉元

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)婦科教研室，南寧530001；2．廣西醫(yī)科大學(xué)研究院，南寧530021）

子宮內(nèi)膜是性激素作用的靶器官，其功能細(xì)胞在月經(jīng)、妊娠及子宮內(nèi)膜疾病等生理與病理方面的作用機(jī)制尚未完全闡明。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)為研究細(xì)胞生長(zhǎng)“分化”代謝以及激素作用機(jī)制提供一個(gè)理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。因此，建立一種可獲得高純度子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系尤為重要，既可用于其生理功能的研究，也可用于子宮內(nèi)膜異位癥、功能失調(diào)性子宮出血、子宮內(nèi)膜癌等多種疾病發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。子宮內(nèi)膜細(xì)胞，即間質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cell，ESC）和腺上皮細(xì)胞（endometrial glandular epithelial cell，EEC）的分離純化方法眾多，當(dāng)前國(guó)外最常用且操作相對(duì)較簡(jiǎn)單的是二次篩網(wǎng)過濾法［2－3］。本研究通過在二次篩網(wǎng)過濾法的基礎(chǔ)上根據(jù)自身試驗(yàn)條件對(duì)之加以改良，以探索一種相對(duì)簡(jiǎn)單易行的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離方法，并對(duì)分離人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的存活率和純度進(jìn)行判定，為子宮內(nèi)膜細(xì)胞相關(guān)課題研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來(lái)源和采集 本試驗(yàn)所采集的10例子宮內(nèi)膜組織均來(lái)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院婦科因“子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌癥”行開腹或經(jīng)腹腔鏡下全子宮切除術(shù)的患者?；颊吣挲g38～49歲，平均（42．26±3．58）歲，術(shù)前3個(gè)月均未經(jīng)激素藥物治療。術(shù)中取得子宮內(nèi)膜組織后，立刻投入無(wú)菌生理鹽水內(nèi)快速清洗，初步洗去血污及雜質(zhì)，然后放入含無(wú)菌預(yù)冷DMEM／F－12培養(yǎng)液（含雙抗）中，于30min內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。本試驗(yàn)涉及的全部子宮內(nèi)膜均經(jīng)病理檢查證實(shí)為增生期或分泌期子宮內(nèi)膜，并排除子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜炎性病變等。子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本的留取經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且征得其本人同意并簽署了知情同意書。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 主要試劑 D′hanks液（捷瑞生物工程有限公司，上海）；DMEM／F－12（賽默飛世爾公司，北京）；青霉素、鏈霉素混合液、0．25%胰蛋白酶、4．00%多聚甲醛（均來(lái)自索萊寶公司，北京）；胎牛血清（天杭生物科技公司，浙江）；0．25%I型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)）；細(xì)胞角蛋白抗體、波形蛋白抗體（均為Boster公司，武漢）；SP－9000免疫組織化學(xué)試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京）；FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體、兩步法抗兔／鼠通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（中山生物技術(shù)有限公司，北京）。

1．2．2 儀器 水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（2323－2，SHEL LAB生產(chǎn)）；電熱恒溫水溫箱（SHH．W21．600S，上海躍進(jìn)醫(yī)療廠生產(chǎn)）；潔凈工作臺(tái)（SW－CJ－IF，蘇州安泰空氣技術(shù)公司生產(chǎn)）；倒置式生物顯微鏡（CKX41SF，Olympus生產(chǎn)）；高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5430R，Eppendorf生產(chǎn)）。

1．3 方法

1．3．1 人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離、純化及傳代 所取到的內(nèi)膜組織參照文獻(xiàn)［4］的方法加以改良，具體步驟如下。（1）清洗：用D′hanks液將新鮮刮取的內(nèi)膜組織清洗3次，盡量將血污及雜質(zhì)清除干凈，將清洗后的組織剪碎約為1mm3，肉眼呈糊狀；（2）消化：加入0．25%I型膠原酶400μL，37℃恒溫水浴8min左右，期間適度振蕩4～5次。加入3倍體積DMEM／F－12培養(yǎng)液終止消化；（3）純化：細(xì)胞懸液依次過100目及400目細(xì)胞過濾網(wǎng)并用培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞網(wǎng)，收集其表面的腺上皮細(xì)胞團(tuán)。得到的2種細(xì)胞懸液分別進(jìn)行離心（1 000r／min×10min），棄上清液，保留細(xì)胞沉淀；（4）培養(yǎng)和傳代：按細(xì)胞密度為105／mL接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。次日換液，之后每48～72小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞換液。待細(xì)胞鋪滿瓶底后，用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）進(jìn)行消化傳代［2］。傳代后的細(xì)胞平均分成2瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1．3．2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 每天于倒置相差顯微鏡下觀察2種內(nèi)膜細(xì)胞的形態(tài)與生長(zhǎng)規(guī)律。

1．3．3 免疫細(xì)胞化學(xué)法染色 （1）細(xì)胞爬片：以細(xì)胞濃度為106／mL的細(xì)胞懸液接種于放有無(wú)菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿90%后，取出細(xì)胞爬片。4．0%多聚甲醛固定細(xì)胞，0．1%～0．2%聚乙二醇辛基苯基醚通透細(xì)胞。5．0%正常山羊血清孵育30min后棄血清；（2）分別加入角蛋白抗體、波形蛋白抗體（工作濃度均為1∶50），同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照（用PBS代替一抗），4℃濕盒內(nèi)過夜。次日復(fù)溫后滴加稀釋的二抗，37℃孵育30min，采用SP法進(jìn)行染色（滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶乳白素工作液）。中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1．3．4 免疫細(xì)胞熒光 （1）細(xì)胞爬片：同免疫細(xì)胞化學(xué)；（2）加入一抗（此步驟同免疫細(xì)胞化學(xué)），（避光）加入熒光標(biāo)記二抗，即FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37℃孵育1h后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核10min。50%～90%甘油封片，指甲油封片的四周，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2．1 培養(yǎng)結(jié)果 所取10例標(biāo)本成功分離并培養(yǎng)出ESC和EEC的例數(shù)為8例，其余2例均為培養(yǎng)過程中真菌污染。結(jié)果證實(shí)此方法有效、可行且簡(jiǎn)便。

2．2 細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)觀察 （1）ESC：接種后約2h左右開始貼壁，此時(shí)，可觀察到2種形態(tài)的細(xì)胞：梭形細(xì)胞占多數(shù)，少量呈多角形。ESC細(xì)胞質(zhì)飽滿，核居中且圓，細(xì)胞呈平鋪生長(zhǎng)。ESC易傳代，連續(xù)培養(yǎng)3～4d后，細(xì)胞逐漸延伸成長(zhǎng)梭形，平行排列成束，密度大的區(qū)域則成團(tuán)生長(zhǎng)（圖1），最長(zhǎng)可存活數(shù)月；（2）EEC：一般于接種后24h左右開始貼壁，細(xì)胞呈蝌蚪形或多角形，細(xì)胞質(zhì)豐富，核圓而大，細(xì)胞邊界清楚，排列緊密（圖2），約4d后呈漩渦狀排列生長(zhǎng)。EEC平均生長(zhǎng)時(shí)間約為6周。在EEC培養(yǎng)過程中會(huì)摻雜少量ESC。子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞經(jīng)首次傳代后生長(zhǎng)力旺盛，大約5～6d可再次傳代。與文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道相符合。

圖1 光學(xué)顯微鏡下ESC細(xì)胞影像學(xué)表現(xiàn)（×100）

圖2 光學(xué)顯微鏡下EEC細(xì)胞影像學(xué)表現(xiàn)（×100）

2．3 子宮內(nèi)膜細(xì)胞的純度鑒定 ESC的特異性標(biāo)志分子為波形蛋白，EEC的特異性標(biāo)志分子為細(xì)胞角蛋白。陽(yáng)性結(jié)果判定：ESC與EEC均為細(xì)胞質(zhì)染色，棕黃色視為陽(yáng)性染色；方法為：在低倍鏡下每張蓋玻片隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色陰性細(xì)胞數(shù)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，ESC角蛋白染色陰性，波形蛋白染色陽(yáng)性，陽(yáng)性率95%，陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，核為藍(lán)色（圖3）；EEC角蛋白染色陽(yáng)性，波形蛋白染色陰性，陽(yáng)性率90%，陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色，核為藍(lán)色（圖4）。

圖3 ESC細(xì)胞染色影像學(xué)表現(xiàn)（×200）

圖4 EEC細(xì)胞染色影像學(xué)表現(xiàn)（×200）

圖5 ESC細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果（×200）

圖6 EEC細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果（×200）

2．4 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果 （1）ESC角蛋白染色陰性，波形蛋白染色陽(yáng)性，陽(yáng)性率95%，陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)呈熒光反應(yīng)，核為藍(lán)紫色（圖5）；（2）EEC角蛋白染色陽(yáng)性，波形蛋白染色陰性，陽(yáng)性率90%，陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)呈熒光反應(yīng)，核為藍(lán)紫色（圖6）。

3 討 論

3．1 成功建立高純度子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的重要意義

目前，子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病公認(rèn)的一種有效途徑，應(yīng)用子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離純化及培養(yǎng)技術(shù)，建立人子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，可對(duì)胚胎著床，月經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制和子宮內(nèi)膜異位癥的產(chǎn)生機(jī)制等進(jìn)行基礎(chǔ)研究，并且可為研究藥物作用機(jī)制及腫瘤發(fā)生等提供有效的手段［7－8］。

3．2 人子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞體外培養(yǎng)的主要影響因素 子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞能否成功培養(yǎng)與以下因素密切相關(guān)：細(xì)胞的活力、純度及細(xì)胞的接種密度［9］。目前，有文獻(xiàn)主張應(yīng)用復(fù)合酶進(jìn)行組織的消化，經(jīng)過多次試驗(yàn)，最終認(rèn)為I型膠原酶對(duì)細(xì)胞的活力影響較小，性價(jià)比較高，與許艷麗等［10］研究結(jié)論相符。本研究采用的標(biāo)本均來(lái)自無(wú)菌條件下刮取的子宮內(nèi)膜組織，并立即放入含雙抗的培養(yǎng)液中，最大程度避免了污染。此外，有研究表明，適當(dāng)增加沖洗組織標(biāo)本的次數(shù)有利于將血污及黏液的進(jìn)一步去除，并可清除病原體［11］。消化后得到的懸液中包括ESC、EEC及紅細(xì)胞等其他雜質(zhì)細(xì)胞，其中，ESC和EEC可分別通過400目及100目細(xì)胞篩網(wǎng)，而紅細(xì)胞及其他雜質(zhì)細(xì)胞則極少能通過100目細(xì)胞篩網(wǎng)。故本研究采用分次篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，離心后可得到較純的ESC懸液及EEC懸液。Arnold等［12］認(rèn)為，若在接種時(shí)細(xì)胞的密度過稀，則可因?yàn)榧?xì)胞之間失去相互支持，而最終導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。作者認(rèn)為在接種細(xì)胞時(shí)ESC以105／mL濃度，EEC則以500／mL的濃度進(jìn)行接種比較適宜。在進(jìn)行原代培養(yǎng)的過程中，還有國(guó)外學(xué)者采用2種細(xì)胞混合培養(yǎng)作為體外細(xì)胞模型［13－14］，此種方法有待進(jìn)一步探索。此外，人子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞分離、培養(yǎng)過程不改變細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)，可通過特異性抗體免疫標(biāo)記離體細(xì)胞以鑒定培養(yǎng)結(jié)果［4］。本試驗(yàn)中角蛋白與波形蛋白進(jìn)行細(xì)胞鑒定的成功充分說(shuō)明了這一點(diǎn)。

在本試驗(yàn)的探索過程中，可總結(jié)以下經(jīng)驗(yàn)：（1）消化時(shí)采用終濃度為0．1%I型膠原酶，消化時(shí)間為8min左右得到的細(xì)胞較多、活力較好；（2）低速單次離心（1 000r／min×10min）細(xì)胞的損傷較小；（3）取材時(shí)盡量去除血污及雜質(zhì)，并在次日換液，能更好地去除混雜的紅細(xì)胞，以減少紅細(xì)胞破裂死亡后釋放的酶對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生的影響；（4）細(xì)胞消化傳代時(shí)用含0．02%EDTA的0．25%胰蛋白酶效果佳，因EDTA為一種螯合劑，可對(duì)貼壁細(xì)胞起到一定的解離作用［15］；（5）原代細(xì)胞在分離培養(yǎng)過程中易被污染，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作要求。

總之，本方法采用單酶（膠原酶）消化和細(xì)胞篩網(wǎng)2次過濾并低速離心，成功分離獲取高純度的子宮內(nèi)膜ESC和EEC且沒有改變其細(xì)胞特征。本方法具備操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低、所需試劑少等優(yōu)點(diǎn)，且分離培養(yǎng)的細(xì)胞純度高，可為進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜細(xì)胞相關(guān)生理病理機(jī)制提供滿意的體外細(xì)胞平臺(tái)。

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