超早期高壓氧對大鼠局灶性腦缺血后梗死體積及腦組織水含量的影響

何慶權，張志強，張立新

急性缺血性腦血管病是導致人類死亡的主要疾病之一。在缺血中心不可逆壞死區(qū)與正常腦組織之間存在處于低灌注狀態(tài)的缺血半暗帶[1]，如能及時恢復血流或采用藥物干預，則可能被挽救，否則轉為不可逆損傷。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)治療具有改善組織缺氧，維持細胞能量代謝，保護血腦屏障，減輕腦水腫，保護梗死周圍缺血半暗帶組織，改善腦梗死預后的作用[2]。目前關于HBO治療腦缺血的研究較多，但多數(shù)以腦缺血再灌注的實驗模型為主，而臨床上人類腦缺血發(fā)病更接近于持續(xù)腦缺血模型。目前國內(nèi)外對HBO治療的時間窗的研究已有不少報道：有研究表明對于持續(xù)性腦缺血HBO治療時間窗一般在缺血2h之內(nèi)[3-7]，而缺血3h或6h后進行治療對梗死灶大小和神經(jīng)功能無影響[8]。因此，如果條件允許，應盡早給予HBO治療。本研究選擇在腦缺血后超早期給予HBO治療，通過檢測缺血后12h腦組織含水量及梗死體積的測定，探討超早期HBO治療對腦缺血的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物及分組：選取健康雄性SD大鼠60只，體質量250～300g，購自中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物部。適應性飼養(yǎng)1周，自由進食水，室溫22℃，12h明暗交替。將60只大鼠隨機分為假手術組、對照組和HBO組各20例。②動物模型的制備：參照Longa等[9]報道的方法建立大鼠局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛(0.3～0.5ml/100g體質量)將大鼠麻醉成功后，仰臥位固定，取頸正中切口，鈍性分離暴露左側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)及頸外動脈(extenal carotid artery，ECA),在ICA和 ECA分叉處結扎ECA，并結扎CCA近心端。在距ICA和 ECA分叉約0.5cm處的CCA用4.5號針頭扎一直徑0.35mm的小口，將直徑0.309mm、長5cm的尼龍線經(jīng)頸總動脈插入ICA，入顱至大腦前動脈起始部，閉塞大腦中動脈起始部，進線長度為距ICA和 ECA分叉18～20mm，至稍有阻力感，動脈出血停止。然后將尼龍線結扎固定于CCA上，逐層縫合至皮膚。大鼠于術后約2～4h后清醒，清醒后右側肢體功能障礙，行動遲緩，進食水情況較差。清醒后行神經(jīng)功能評分，1～3分提示造模成功，0分及4分者剔除。

1.2 方法 HBO組：給予HBO治療，應用煙臺宏遠GY3200型氧艙進行治療，于氧艙常壓空氣環(huán)境下完成栓塞大鼠左側大腦中動脈，栓線成功后立即加壓吸氧，升壓時間10min，維持壓力2.0ATA，穩(wěn)壓后吸純氧60min，減壓時間10min。對照組：常壓空氣條件下栓塞大鼠左側大腦中動脈，不行HBO治療。假手術組：栓線僅插入1cm，不阻斷大腦中動脈，不行HBO治療。

1.3 評定標準 所有大鼠均在模型制作成功后12h取材。①神經(jīng)功能評分：動物清醒后及取材前評價，采用zea longa 5分制評分標準進行評分：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向外轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。②腦梗死體積測定：用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色的方法測定梗死體積。各組大鼠于相應時間點麻醉后斷頭取腦，于-20℃冰箱冰凍20min，取出后從大腦與小腦之間從后向前切取2mm厚的切片6片，浸于2%的TTC溶液中放入37℃溫箱中染色20min，不時翻動腦片使兩面染色均勻，第一刀在腦前極與視交叉連線中點處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。正常腦組織被染成紅色，梗死區(qū)腦組織呈白色。取出后于4%的多聚甲醛中固定24h，數(shù)碼相機雙面腦片拍照，應用Nis-Elements Br3.0分析軟件計算梗死體積百分比。③腦組織含水量：采用干濕法檢測。各組大鼠于相應時間點麻醉后斷頭取腦，切開左右半腦，用電子天平準確稱其濕重，放置于100℃烤箱24h，烘干至衡重后用電子天平稱其干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

2 結果

神經(jīng)功能缺損評分比較，假手術組為0分，HBO組大鼠評分明顯低于對照組(P<0.05)。腦梗死體積結果顯示，大鼠腦切片TTC染色可見正常腦組織被染成紅色，梗死區(qū)腦組織不能被染色，呈白色；HBO組大鼠腦梗死體積較對照組明顯降低(P<0.05)。腦組織含水量比較，對照組較假手術組和HBO組明顯升高(P<0.05)。見表1。

組別n神經(jīng)缺損評分(分)腦梗死體積(%)腦組織含水量(%)HBO組201.68±0.73a13.46±0.84a80.01±0.85a對照組202.26±0.5021.18±1.7984.43±0.78b假手術組200077.89±0.45a

與對照組比較，aP<0.05；與假手術組比較,bP<0.05

3 討論

由于HBO治療能明顯增加機體對氧的攝取和利用，使血氧含量增加，血氧分壓增高，氧彌散能力增強，是治療各種缺氧性疾病的有效措施。局灶腦缺血后組織缺氧是細胞損傷的主要原因之一，HBO可以改善組織供氧，維持細胞能量代謝，保護血腦屏障，減輕腦水腫，因此HBO治療被認為是治療腦缺血較具潛力的方法之一。目前較公認的理論是腦缺血核心區(qū)周圍是缺血半暗帶，缺血半暗帶可隨著供血及供氧的恢復轉化為正常灌注區(qū)，否則將轉化為梗死區(qū)。因此盡早改善半暗帶區(qū)供氧是HBO治療腦缺血的理論基礎[10]。

本實驗中選擇造模成功后立即進行HBO治療，在腦缺血形成過程中維持缺血區(qū)腦組織供氧及供血，減小缺血半暗帶區(qū)，造模后12h取腦經(jīng)TTC染色，發(fā)現(xiàn)HBO組大鼠較對照組大鼠腦梗死體積明顯減小，神經(jīng)缺損評分明顯降低。相似研究表明，HBO治療應在腦缺血早期進行，才能改善神經(jīng)功能。在全腦缺血模型中，Yang等[11]發(fā)現(xiàn)HBO治療促進全腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復，改善存活率，病理研究也證實HBO治療能減少全腦缺血后海馬CAI神經(jīng)元的遲發(fā)型死亡[12]。應用局灶性腦缺血模型，Veltkamp等[13]顯示缺血后早期HBO治療顯著改善短暫性腦缺血(75min)后行為功能恢復，并減少梗死體積，尤其是皮層梗死。而Sunami等發(fā)現(xiàn)永久性局灶腦缺血后 10min用HBO治療能減少18%的梗死體積[14]。有研究運用MRI成像研究證實，永久性腦缺血后2h應用HBO治療有效，且并無氧化損傷[15]。Badr等[16]在腦缺血后不同時間點應用HBO治療，發(fā)現(xiàn)僅在短暫性腦缺血后6h內(nèi)HBO治療才能改善神經(jīng)功能。因此，HBO治療腦缺血有時間窗，在病情允許的情況下，應盡早進行HBO治療以減輕腦梗塞體積，減輕癥狀。

HBO治療能降低腦水腫可能的機制：①HBO可使腦血管收縮，從而減輕水腫[17]；②HBO能改善缺氧，有利于腦細胞代謝，切斷腦缺氧和水腫之間的惡性循環(huán)，從而減輕水腫[18-19]；③HBO能改善和恢復大腦微血管內(nèi)皮細胞，從而能減輕水腫[20]。此外，HBO治療能減少梗死體積，其原因可能是HBO能增加缺血區(qū)的細胞供氧，從而減少梗死體積和神經(jīng)損傷程度[21]，從而改善腦組織缺氧狀態(tài)。HBO能提高血氧張力，促進血管收縮，降低顱內(nèi)壓，有利于受損組織的恢復。HBO還使缺血部位的腦血流量增加，糾正缺血部位的酸中毒，改善微循環(huán)，促進側支循環(huán)保護腦細胞免受氧自由基損傷。在HBO暴露下,微動脈收縮、微靜脈無明顯變化,因此我們推測, HBO條件下毛細血管內(nèi)血壓下降,這將有利于組織液吸收,從而起到減輕組織間隙水腫的作用。同時HBO使毛細血管內(nèi)血氧含量增加,腦血流雖有所減少,但組織供氧反而增加,這是其它血管收縮因素所不能替代的[22]。腦缺血半暗帶區(qū)氧供的迅速而有效地改善，可為因缺血而處于瀕危的組織提供能量供應，降低腦組織對擴散阻抑現(xiàn)象(spreading depressions, SD)的敏感性， 防止瀕危組織能量的進一步耗竭。對缺血核心區(qū)谷氨酸鹽和乳酸鹽的微量分析研究表明，HBO 可降低神經(jīng)組織缺血損傷后的興奮性毒性水平。此外，還有報道表明，HBO還具有促進自由基清除劑基因表達、抑制白細胞黏附和再灌注損傷的作用[23]。為防止氧中毒等HBO可能的毒性作用和不良反應，我們采取了每吸氧1 h后改吸1h高壓空氣的間斷方法，以提高動物對HBO的耐受性[24]。

近期的研究結果表明[25-26]，HBO的腦保護作用可能與能保護血腦屏障、抑制炎癥反應和細胞凋亡、增強促進細胞存活基因Bcl-2表達、減少環(huán)氧化酶-2mRNA和蛋白質水平、減少多種凋亡基因表達，如誘導因子-1α、P54、caspase-9及caspase-3 等相關。

本實驗中選擇線栓造模成功后即刻進行HBO治療，證實超早期HBO治療可以減低腦水腫，減小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。這與之前的研究結果相一致。今后的研究中應對其產(chǎn)生上述作用的具體機制進行研究。綜上所述，大鼠局灶性腦缺血后，給予超早期HBO治療可以減輕腦水腫，減小腦梗死體積，進而改善神經(jīng)功能。

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沉痛悼念王培生教授

《中國康復》雜志第1屆、第2屆、第3屆編輯委員會副主編王培生教授因病醫(yī)治無效，于2014年12月30日22時逝世，享年84歲。

王培生教授于1930年10月出生于湖北黃岡，1949年7月參加革命工作，1953年1月加入中國共產(chǎn)黨。50年代起，在湖北醫(yī)學院第一醫(yī)院工作，為醫(yī)院乃至湖北省的醫(yī)學學科建設，發(fā)揮了重要、積極作用。1981年進入華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院工作，1996年1月離休。曾任湖北醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院醫(yī)政科科長、華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院副院長、梨園醫(yī)院老年康復中心主任、湖北省醫(yī)學會物理醫(yī)學與康復專業(yè)委員會主任委員、湖北省康復醫(yī)學會副會長。在擔任《中國康復》雜志副主編期間，為雜志的發(fā)展盡心盡力，做出了卓越貢獻。

王培生教授熱愛中國共產(chǎn)黨，熱愛祖國，熱愛醫(yī)療事業(yè)。在擔任梨園醫(yī)院副院長期間，積極開展各項工作，注重調查研究。他于1981年創(chuàng)建了湖北省梨園醫(yī)院理療科，于1988年牽頭成立了湖北省梨園醫(yī)院老年康復中心，并以身作則，帶領大家奮力拼搏，精益求精，在短時間內(nèi)使得理療科和老年康復中心當時的規(guī)模和技術水平達到省內(nèi)領先地位。他一生致力于康復醫(yī)學研究，即便是在離休后，仍不顧高齡，繼續(xù)參加與康復有關的各項學術活動，傾心培養(yǎng)學科晚輩。特別是在為《中國康復》雜志審稿中，表現(xiàn)出了老一輩康復專家的高風亮節(jié)和一絲不茍、不懈追求的嚴謹學風，認真對待每一篇稿件，既實事求是、堅持科學、嚴把學術質量關，又不辭辛勞、認真細致、不遺余力地幫助作者和提攜學科新人，深受編輯部編輯和作者們的歡迎與尊敬。

王培生教授一生兢兢業(yè)業(yè)、勤勤懇懇，他的離去，使我們失去了一位深受愛戴的好師長。雖然他離開了我們，但他所樹立的榜樣作用將永存于我們的心中，并將激勵我們化悲痛為力量，勤勉工作，無私奉獻，為發(fā)展我國康復醫(yī)學事業(yè)，造福于廣大患者做出應有的貢獻。

王培生教授永垂不朽！

《中國康復》編輯部