葫蘆科作物未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)研究進(jìn)展

榮文娟　朱迎春　孫德璽　鄧云　劉君璞

摘要：綜述了影響葫蘆科作物未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的因素，總結(jié)了培養(yǎng)獲得植株的倍性鑒定和再生二倍體植株的純合性鑒定方法，同時對單倍體植株的加倍方法進(jìn)行簡要概述，并提出葫蘆科作物未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)中存在的問題，為下步工作研究提供參考。

關(guān)鍵詞：單倍體；加倍方法；葫蘆科；未受精子房；胚珠；離體培養(yǎng)；倍性鑒定；純合性鑒定

中圖分類號：S336；S642.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0004-03

收稿日期：2014-04-09

基金項(xiàng)目：國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號：CARS-26-14）。

作者簡介：榮文娟（1990—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事西瓜遺傳育種研究。E-mail：rong90921@163.com。

通信作者：劉君璞，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事西瓜遺傳育種及栽培技術(shù)研究。E-mail：liujunpu@caas.cn。葫蘆科作物包括多種瓜類蔬菜，廣為人們喜愛且具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。西瓜、甜瓜（Cucumis melo）、黃瓜（C. sativus）、南瓜（C. moschata）等作物栽培面積逐年增大，但連作障礙和土傳病害等影響了它們的產(chǎn)量和品質(zhì)。而葫蘆科作物遺傳背景狹窄，常規(guī)育種周期長，不易獲得目標(biāo)性狀，已很難滿足育種要求。單倍體育種可以快速直接地篩選目標(biāo)性狀，拓寬種質(zhì)資源，從而成為加快育種進(jìn)程獲得新品種的一種高效方法。植物離體雄核和雌核發(fā)育可以獲得單倍體，但對葫蘆科作物而言，通過花藥和小孢子培養(yǎng)（雄核發(fā)育）獲得單倍體的效率很低，誘導(dǎo)未受精的子房和胚珠（雌核發(fā)育）是目前流行的方法[1]。1921年，Blakesly首次在曼陀羅中發(fā)現(xiàn)了單倍體植株，此后單倍體就成為研究熱點(diǎn)。葫蘆科家族通過未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)獲得單倍體的研究也取得了很大進(jìn)展（表1）[2-11]。目前，黃瓜的未受精子房培養(yǎng)已經(jīng)建立了一套再生體系，單倍體培養(yǎng)獲得的材料已經(jīng)和育種實(shí)踐相結(jié)合，并獲得了20多個優(yōu)良的育種材料[12-13]，但誘導(dǎo)頻率卻較低（20%）[14]。裴曉利通過離體誘導(dǎo)黃瓜雌核發(fā)育獲得單倍體并構(gòu)建了其DH群體的SSR標(biāo)記圖譜構(gòu)建[15]；2013年孫守如等通過未受精胚珠培養(yǎng)使胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)到了31.1%，并對其胚胎發(fā)育途徑進(jìn)行了觀察[11]。植物的離體雌核發(fā)育有愈傷組織和胚狀體2條途徑，陳學(xué)軍等通過愈傷組織途徑獲得西葫蘆再生植株[4]，謝冰等通過誘導(dǎo)胚狀體途徑產(chǎn)生再生植株[10，16]。周林等近年來對西瓜未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，但是均未成功獲得再生植株[17-18]。王建設(shè)等研究西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)得到了單倍體植株并公開發(fā)明了其使用的專用培養(yǎng)基[19]。葫蘆科作物未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)獲得的單倍體已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)踐，創(chuàng)造了生產(chǎn)價值，但是培養(yǎng)體中的影響因子眾多，每個作物的培養(yǎng)體系還需要探索優(yōu)化，提高誘導(dǎo)效率。

表1葫蘆科作物未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)的研究結(jié)果

作物外植體結(jié)果參考文獻(xiàn)西葫蘆子房愈傷組織[20]胚珠胚囊再生植株[5，10]子房單倍體[21-22]胚珠單倍體[4]胚珠單倍體，二倍體[23-24]子房異倍體，二倍體，混倍體[25]南瓜子房或胚珠胚狀體[26]胚珠再生植株[11]黃瓜子房胚狀體[21]子房再生植株[13，27]子房和胚珠單倍體，雙單倍體[8]子房單倍體，雙單倍體，混倍體[28]子房二倍體，單倍體，其他倍性[29]甜瓜子房再生植株[30]子房單倍體，二倍體，混倍體[7]西瓜子房單倍體[19，31]

1葫蘆科未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的主要影響因素

葫蘆科作物未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)受供體植株的基因型、生長季節(jié)和胚囊發(fā)育狀態(tài)、培養(yǎng)基、預(yù)處理方式、培養(yǎng)條件等因素影響。

1.1植株的基因型

植株基因型在培養(yǎng)過程中的差異已經(jīng)在很多種作物中得到證實(shí)，不同基因型對作物產(chǎn)生的影響因作物不同而有差異[1，32]。Caglar等對27種不同的黃瓜母本進(jìn)行了研究，結(jié)果證明，不同的基因型在輻射花粉誘導(dǎo)孤雌生殖產(chǎn)生單倍體的誘導(dǎo)率沒有很大差異[33]。此后，F(xiàn)aris等用8種不同基因型的黃瓜進(jìn)行試驗(yàn)，證明同一輻射劑量下的單倍體發(fā)生頻率同基因型沒有關(guān)系[34]。謝冰等研究西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)結(jié)果表明，基因型較接種的胚胎發(fā)育時期和培養(yǎng)基組成對胚狀體誘導(dǎo)率的影響較小[10]。裴曉利等研究了9種黃瓜子房切片對誘導(dǎo)培養(yǎng)基的反應(yīng)，誘導(dǎo)率變化范圍為65.52%～9333%[15]。同一品種的不同外植體需要的培養(yǎng)基也不一樣，Shalaby等發(fā)現(xiàn)南瓜的子房和花藥在同一培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果完全不一樣[23]。在未受精子房和胚珠培養(yǎng)技術(shù)體系中，基因型的反應(yīng)因不同的培養(yǎng)技術(shù)而不同，針對不同的基因型改良培養(yǎng)體系或許可以提高胚狀體誘導(dǎo)率。

1.2生長季節(jié)和胚囊發(fā)育狀態(tài)

適當(dāng)?shù)纳L季節(jié)可給植株提供優(yōu)良生長發(fā)育環(huán)境，植株可達(dá)到良好生理狀態(tài)，胚囊也可有較好的發(fā)育狀態(tài)。魏愛民等研究了植株栽培季節(jié)對黃瓜未受精子房離體培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，胚狀體發(fā)生率和植株再生率在溫度相對較高的6月下旬、7月上旬及9月明顯高于其他季節(jié)，植株生長發(fā)育前期好于后期[35]。謝冰等在研究西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)不同品種秋播材料的誘導(dǎo)頻率最高，且認(rèn)為這可能與西葫蘆是短日性植株有關(guān)[10]。很多研究者認(rèn)為，成熟期或接近成熟的胚囊的細(xì)胞容易誘導(dǎo)孤雌生殖[36]。牛明明在未受精子房離體培養(yǎng)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外植體最佳取材時間是16：00—17：00，采取開花前一天的子房誘導(dǎo)率最高[37]。王朝陽認(rèn)為，西葫蘆植株開花當(dāng)天和花前一天取胚囊的誘導(dǎo)率差異不明顯[16]。孫守如等認(rèn)為，雌花開放當(dāng)天的胚囊已經(jīng)發(fā)育成熟或接近成熟，出胚率最高[11，38]。Gémes-Juhúsz 等發(fā)現(xiàn)，黃瓜雌花開放前6 h的胚囊剛好成熟，胚的誘導(dǎo)率最高[28]。目前，成功誘導(dǎo)離體雌核發(fā)育的植物多數(shù)是接種胚囊單核期至接近成熟期的子房或胚珠，而接種大孢子發(fā)生時期的子房或過于幼嫩的子房則難以誘導(dǎo)雌核離體發(fā)育[5-6，11]。

在不同的季節(jié)，不同的葫蘆科作物植株生理狀態(tài)不一樣，開花時間和胚囊發(fā)育也會不同，用開花時間來判斷胚囊發(fā)育達(dá)到成熟狀態(tài)進(jìn)行觀察驗(yàn)證[39]。

1.3培養(yǎng)基

通常未受精子房或胚珠培養(yǎng)技術(shù)研究中的培養(yǎng)基是研究者注重的部分。從子房或胚珠獲得再生植株的程序一般是胚珠或子房在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出胚狀體，轉(zhuǎn)接到再生培養(yǎng)基中使之成為植株；若在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長出愈傷組織，則還須在分化培養(yǎng)基上進(jìn)一步分化出芽，再進(jìn)一步誘導(dǎo)成為完整植株。研究者通常根據(jù)自己的需要調(diào)整培養(yǎng)基配方，以達(dá)到目的。培養(yǎng)基中除了基本培養(yǎng)基成分可調(diào)整外，往往還會通過添加激素、AgNO3、活性炭等進(jìn)行組合分析。

有研究發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基H和MS沒有明顯區(qū)別，大多數(shù)用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或其改良型[40]?；九囵B(yǎng)基中的蔗糖可以給外植體提供能量和維持一定的滲透壓，一般認(rèn)為3%～4%的蔗糖濃度適合未授粉子房的誘導(dǎo)[41]。在添加了40 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，西瓜未受精子房培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)率最高[18]。陳學(xué)軍等認(rèn)為，培養(yǎng)基中不加任何外源激素不能誘導(dǎo)子房的膨大和雌核發(fā)育[4]。陳勁楓等研究了黃瓜子房培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.04 mg/L 2，4-D使胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)72.7%[29]。李建欣等認(rèn)為，不同濃度的6-BA和NAA對植株再生率的影響不同[42]。Malik等研究的甜瓜未受精子房[43]、刁衛(wèi)平等研究的黃瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)[44]結(jié)果都表明，適宜濃度的TDZ對胚胎形成有促進(jìn)作用。孫守如等調(diào)整南瓜未受精胚珠培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基并篩選了最佳組合，為MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，使用AgNO3對胚狀體的形成有明顯的抑制作用[11]。

1.4預(yù)處理方式

在接種作物的子房或胚珠時，一般要先進(jìn)行預(yù)處理以提高出胚率。對預(yù)處理方式的研究主要集中在溫度上[2]。Gemes-Juhúsz等在黃瓜未受精子房試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低溫預(yù)處理使誘導(dǎo)率降低，而經(jīng)過28 ℃或者35 ℃高溫預(yù)處理的黃瓜出胚率和植株再生率比較高[28]。周林在進(jìn)行西瓜子房培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，4 ℃ 預(yù)處理72 h的誘導(dǎo)效果最好[17]。在南瓜、西葫蘆未受精胚珠培養(yǎng)的研究中，很多研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)過適宜時間的黑暗 35 ℃ 熱激有利于胚狀體的形成[10，15，42]。在水稻、小麥、辣椒和蘿卜等作物的單倍體培養(yǎng)中，用甘露醇、秋水仙素和不同濃度蔗糖等進(jìn)行預(yù)處理方式較多，可以進(jìn)行嘗試。

1.5培養(yǎng)條件

極大多數(shù)未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)的研究中采用固體培養(yǎng)基[12-16]，Lotfi等在誘導(dǎo)甜瓜雌核發(fā)育時采用液體E20培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)黃瓜單倍體胚時也采用液體培養(yǎng)，這樣便于檢測單倍體胚[30]。一般胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)和分化溫度在 24～30 ℃之間，相對濕度為60%～80%，培養(yǎng)基的pH值以 5.8～6.0 為宜，在葫蘆科作物中，前期暗培養(yǎng)約1周，后期采用恒溫恒光的培養(yǎng)方式效果最佳[39]。對黃瓜未受精子房誘導(dǎo)的研究結(jié)果表明，25 ℃下黑暗預(yù)培養(yǎng)1 d能提高雌核發(fā)育的反應(yīng)率[45]。在植物的組織培養(yǎng)中，有大量研究光質(zhì)對組織培養(yǎng)中愈傷組織生長分化有影響；光質(zhì)也影響大蒜、蘿卜、辣椒、葡萄等愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和分化[46]；在葫蘆科作物未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)中，光質(zhì)對胚狀體的發(fā)生和植株再生的影響未見研究報道。

2植株的倍性鑒定和純合性鑒定

通常通過未受精子房或胚珠離體培養(yǎng)得到植株的倍性不確定，根尖染色體觀察、流式細(xì)胞儀測定、分子手段測定、細(xì)胞學(xué)觀察及田間觀察等方法可以鑒定再生植株的倍性[47]。根尖染色體計數(shù)是確定植株倍性最精確的一種方法，但對培養(yǎng)過程中自然加倍的植株無法鑒定其純合性。流式細(xì)胞儀鑒定相對比較昂貴，對于二倍體和多倍體植株的純合性依然無法鑒定。王璐等得到的再生植株經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定為二倍體，之后通過田間性狀觀察比較初步鑒定為雙單倍體植株[45]。對再生植株利用分子標(biāo)記手段進(jìn)行的鑒定迅速可靠。Diao等用SSR分子標(biāo)記手段鑒定黃瓜子房培養(yǎng)獲得的二倍體植株的純合性，再生的二倍體植株中有51.5%鑒定為雙單倍體植株[29]。蘇敏等用EST-SSR鑒定西葫蘆再生植株的倍性水平，并通過保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計數(shù)法及流式細(xì)胞儀證實(shí)SSR標(biāo)記分析的結(jié)果是可靠的[48]。研究者可以在可能的情況下，利用多種手段快速準(zhǔn)確地確定再生植株的倍性水平。

3單倍體植株加倍

獲得的再生單倍體植株加倍方法有自然加倍和人工加倍，其中自然加倍的頻率受植株基因型影響[49]。葫蘆科染色體人工加倍主要用秋水仙素處理[2，50-51]。Caglar等分析黃瓜單倍體染色體加倍，表明植株浸入0.5%秋水仙堿處理 4 h，達(dá)到60%的最高平均加倍效率[52]。Niemirowicz-Szezytt等的早期試驗(yàn)顯示，須在試管中用0.1%秋水仙堿多次（3～5次）處理植株的分生組織尖才可獲得比較好的加倍結(jié)果[50]。有研究以黃瓜單倍體再生植株的葉子作為外植體接種加倍，比用秋水仙堿處理更有效[53]。Faris等用單倍體植株的第1、第2張葉片為外植體直接再生出黃瓜的雙單倍體系（DHs），因此再生組織的發(fā)展年齡可能是染色體加倍效率的重要影響因素[54]。

4存在問題及展望

葫蘆科作物中的黃瓜、南瓜、甜瓜和西瓜種植范圍廣且有很高經(jīng)濟(jì)價值，人們對其品質(zhì)和產(chǎn)量的需求也不斷提高。傳統(tǒng)育種方法培育新品種周期長且難以選到目標(biāo)性狀，單倍體育種和傳統(tǒng)育種方法結(jié)合則能很快獲得大量種質(zhì)資源，直接選育新品種。雌核發(fā)育是通過誘導(dǎo)獲得單倍體的一條途徑，葫蘆科作物黃瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜通過未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)也獲得了單倍體植株。但是，目前的研究中還有兩方面值得深入：第一，通過未受精子房和胚珠誘導(dǎo)單倍體成功獲得再生植株的誘導(dǎo)率還不高，沒有建立獲得高胚狀體發(fā)生率和植株再生率的完整培養(yǎng)體系；第二，關(guān)于雌核發(fā)育誘導(dǎo)機(jī)制的研究還處于空白狀態(tài)，缺乏基因調(diào)控層面的研究，培養(yǎng)過程中引起細(xì)胞學(xué)變化和生理生化變化的研究也較少。未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究還處于初步階段，隨著以后研究的深入探索，能獲得更多利用單倍體及其雙單倍體系育種的信息，真正和育種工作相結(jié)合，提高育種效率，縮短育種年限。

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