基于組培快繁技術(shù)的白及種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)觀察

崔瑞勤　陳科力　徐雷

摘要：為掌握白及實生苗培育過程中的生長發(fā)育特點(diǎn)，采用種子組培快繁技術(shù)育苗，并對該過程進(jìn)行動態(tài)觀察。在1/2MS+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行種子萌發(fā)及叢生芽誘導(dǎo)，7 d后種子膨大成為淡黃色球狀體，21 d后種子突破種皮開始萌發(fā)，30 d后開始形成原球莖，40 d后原球莖進(jìn)一步膨大、顏色逐漸轉(zhuǎn)綠，部分誘導(dǎo)出愈傷組織，2個月后原球莖基部出現(xiàn)絨毛狀，愈傷組織分化大量叢生芽。叢生芽在1/2MS+1.0 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+ 1.0 mg/L GA3培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，約40 d即可培養(yǎng)出3～5條幼根，此后白及幼苗快速生長，即可進(jìn)行煉苗移栽。

關(guān)鍵詞：白及；種子；組培快繁技術(shù)；萌發(fā)；幼苗形態(tài)；觀察

中圖分類號： S567.23+9.04文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0238-03

收稿日期：2014-04-24

基金項目：國家扶持中藥材生產(chǎn)建設(shè)項目。

作者簡介：崔瑞勤（1991—），女，碩士研究生，從事中藥資源及其品質(zhì)研究。E-mail：18995629089@163.com。

通信作者：徐雷，博士研究生，講師，從事中藥資源及其品質(zhì)研究。E-mail：wuhanxulei@163.com。白及[Bletilla striata （Thunb.） Reichb. f.]為蘭科白及屬多年生草本植物，是我國的野生資源，主要分布區(qū)域北起江蘇、河南，南至臺灣，東起浙江，西至西藏東南部。貴州的東部、西部、南部，廣西的西北、西南山區(qū)是野生白及資源的集中分布地及藥材產(chǎn)出中心[1]。當(dāng)前，貴州、云南、廣西、安徽、浙江、江西、湖北、四川等地均有白及人工栽培，以貴州、安徽、廣西三地栽培量大質(zhì)優(yōu)[2]。白及干燥塊莖可供藥用，具收斂止血、消腫生肌的功效，用于咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥[3]。白及在我國具有悠久的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，距今已有2 000多年歷史，是我國民間的傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代研究表明白及主要活性成分為聯(lián)芐類、二氫菲，并含聯(lián)菲類、其他含菲化合物以及甾類、萜類、酯類、醚類等化合物，具有止血、抗菌、抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附生長以及保護(hù)黏膜等藥理作用[4-5]。

白及不僅具有較高的藥用價值，同時還具有較強(qiáng)的觀賞性，也是我國現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原材料，由于白及應(yīng)用廣泛，近年來市場需求量不斷增大，在繁殖受限、人工栽培量不足的背景下，其野生資源遭到大量采挖，伴隨供需矛盾的不斷凸顯，白及的價格逐年攀升。目前我國白及資源十分短缺，大量地肆意采挖致使白及野生資源急劇減少，自然生境遭到嚴(yán)重破壞，由于其瀕危稀缺，被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物之一。

當(dāng)前白及大規(guī)模人工栽培顯得尤為迫切，盡管白及生長過程中能大量產(chǎn)生種子，但種子極細(xì)小、質(zhì)輕且構(gòu)造簡單無胚乳，不具備自然萌發(fā)所需的足夠養(yǎng)分，自然條件下與相適應(yīng)的真菌共生，由真菌提供其營養(yǎng)才有可能發(fā)芽且萌發(fā)率較低，所以采用種子繁殖培育實生苗進(jìn)行栽培較困難。目前，白及栽培主要采用塊莖分離繁殖的方式，大量消耗經(jīng)濟(jì)部位用于繁殖，繁殖系數(shù)低，難以適應(yīng)規(guī)?；N植的需要，不能滿足市場需求[6]。同時，由于營養(yǎng)繁殖的后代源至母株的營養(yǎng)體的個體發(fā)育并非基于遺傳意義上的重新開始，而是母體生長的延續(xù)，所以這種單一繁殖方式長期使用必然引起品種退化，導(dǎo)致產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、病蟲害加重、適應(yīng)性變差等諸多問題。所以，生產(chǎn)中適當(dāng)采用種子繁殖尤為必要。

采用無菌播種方式進(jìn)行白及種子組培快繁以獲得實生苗，在培養(yǎng)基中配制白及種子萌發(fā)所需的全部養(yǎng)分，種子萌發(fā)率高，而且通常1枚白及蒴果中種子數(shù)量高達(dá)數(shù)十萬，所以繁殖系數(shù)極大，而且以種子進(jìn)行繁殖有利于引種馴化以及優(yōu)良品種選育。所以，本試驗采用組織培養(yǎng)技術(shù)培育白及實生苗，對白及種子的萌發(fā)、叢生芽的誘導(dǎo)、生根定植、移栽等環(huán)節(jié)展開跟蹤觀察，以期為白及大規(guī)模種子組培快繁育苗積累生產(chǎn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

1.1.1材料白及果實采自于湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司中藥材GAP示范園，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳科力教授鑒定為蘭科植物白及的成熟蒴果。

1.1.2儀器HP1500GS-B智能人工氣候培養(yǎng)箱（湖北省武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）；HVE-50高壓蒸汽滅菌器（日本株式會社平山制作所）；BSC1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）

1.1.3試劑瓊脂粉（BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；MS培養(yǎng)基（BR，美國BIOSHARP公司）；NaClO溶液（AR，西隴化工股份有限公司）；赤霉酸（上海滬江生化有限公司）；1-萘乙酸（天津博迪化工股份有限公司）；蔗糖（AR，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）。

1.2方法

1.2.1果實預(yù)處理將白及未開裂成熟蒴果用流水洗凈，在超凈臺上分別用75%乙醇溶液表面消毒1 min，8% NaClO溶液消毒10 min，再用無菌水反復(fù)沖洗4～6次，然后縱向剖開蒴果，用鑷子夾取蒴果外殼，將粉末狀的種子輕輕抖落到培養(yǎng)基表面[7]。

1.2.2培養(yǎng)基制備種子萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2 MS+1.0 mg/L NAA；生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+2.0g/L活性炭+1.0 mg/L GA3，培養(yǎng)基配制后于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光-暗周期12 h-12 h。

1.2.4無菌播種在無菌條件下將白及蒴果縱向剖開，用鑷子夾取蒴果外殼，將種子輕輕抖落到萌發(fā)培養(yǎng)基上，由于每枚蒴果中所含種子數(shù)量高達(dá)數(shù)十萬，因此盡量控制培養(yǎng)基表面種子密度，使其均勻散布（圖1）。endprint

2結(jié)果與分析

2.1叢生芽的誘導(dǎo)

白及種子播種于培養(yǎng)基表面后開始吸水膨脹，7 d后種子明顯變大，顏色變淺，成為淡黃色的球狀體或紡錘體（圖2-a）；接種21 d后種子突破種皮開始萌發(fā)（圖2-b）；30 d 后開始形成淡黃色原球莖，呈球狀（圖2-c）；40 d后原球莖進(jìn)一步膨大顏色逐漸轉(zhuǎn)綠，少數(shù)原球莖頂部出現(xiàn)幼葉，有的原球莖誘導(dǎo)出愈傷組織（圖2-d）；2個月后原球莖基部出現(xiàn)絨毛狀，愈傷組織分化出芽（圖2-e），長出1～2 cm的綠葉，獲得大量叢生芽（圖2-f），少數(shù)形成小的幼苗。在白及種子萌發(fā)和生長過程中發(fā)現(xiàn)，白及種胚通過2種方式形成幼苗，1種方式是種胚萌發(fā)后形成淡黃色的球狀體，進(jìn)一步生長轉(zhuǎn)變?yōu)橹睆綖閹缀撩状笮〉脑蚯o，原球莖分化產(chǎn)生芽，最后發(fā)育形成幼苗（圖2-g）；另1種方式是淡黃色的球狀體伸長成根狀莖后發(fā)育成小苗（圖2-h）。

2.2生根培養(yǎng)

將長至2～3 cm的叢生芽轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，由于加入了誘導(dǎo)根分化的NAA，約40 d即可培養(yǎng)出3～5條幼根，基部都有白色細(xì)密的叢生毛出現(xiàn)（圖3）。在生根的同時幼苗快速生長，株高明顯增加，葉片增多且葉色加深，培養(yǎng)基質(zhì)被快速消耗。

2.3組培苗的移栽

白及苗移栽前要進(jìn)行煉苗，在光照培養(yǎng)箱中打開培養(yǎng)盒蓋，蓋上封瓶膜煉苗2 d，移至室溫下繼續(xù)煉苗5 d，取出小苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至栽培基質(zhì)中（圖4-a）。栽培基質(zhì)按m腐殖土 ∶m蛭石=1 ∶1進(jìn)行配制，使用前消毒，移栽結(jié)束后注意保水保濕。白及苗冬天地上部分枯萎，第2年春天在原球莖基礎(chǔ)上長出新芽（圖4-b）。

3結(jié)論與討論

利用種子組培快繁技術(shù)，通過蒴果消毒、無菌播種、叢生芽誘導(dǎo)、生根誘導(dǎo)和煉苗移栽等環(huán)節(jié)在實驗室條件下能獲得大量白及實生苗，整個過程均在各環(huán)境因子可控條件下完成，但要將組培實生苗用于大田生產(chǎn)，尚須煉苗移栽培育成種苗后定植于大田，通過試驗雖然成功獲得了白及種苗，但由于受本地氣候不適宜白及生長的限制，并沒有進(jìn)行大田栽培實踐，而且目前也很少有用白及組織培養(yǎng)技術(shù)迅速推廣應(yīng)用的相關(guān)報道（僅孟彪等通過誘導(dǎo)原塊莖獲得組培苗而非實生苗進(jìn)行生產(chǎn)試驗，結(jié)果無塊莖的白及組培苗不能成活，且組培苗質(zhì)量優(yōu)劣與其塊莖大小密切相關(guān)，塊莖越大，成活率越高[8]），因此，組培實生苗的大田定植是制約其推廣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

試驗中發(fā)現(xiàn)白及種胚可通過原球莖和根莖2種途徑形成幼苗，2種幼苗在后期的生產(chǎn)性能以及塊莖品質(zhì)均有待深入研究。試驗中從無菌播種到大量產(chǎn)生叢生芽時間較長，需近3個月時間，由于培養(yǎng)基主要提供白及種子萌發(fā)所需養(yǎng)分，不同植物激素及其濃度促進(jìn)生長發(fā)育進(jìn)程，因此培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和激素的含量及其種類對種胚的無菌萌發(fā)和叢生芽的分化具有非常大的影響，是組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵。培養(yǎng)基物理狀態(tài)對白及生長發(fā)育也有影響，采用液體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基可以縮短萌發(fā)時間，但褐化現(xiàn)象較固體培養(yǎng)基嚴(yán)重，古碧珠等采用液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)同科的蘭花種子時也有類似現(xiàn)象[9]。盡管白及種子萌芽和生長發(fā)育是復(fù)雜的生理過程，與其遺傳特性有關(guān)，但與所處營養(yǎng)條件、外源激素、生態(tài)因子等的誘導(dǎo)密切相關(guān)。筆者觀察了在一定條件下白及的生長發(fā)育過程，而關(guān)于其生長發(fā)育進(jìn)程的植物激素調(diào)控和生長條件掌控等方面仍需進(jìn)一步深入研究。

組培實生苗技術(shù)的突破能有效解決白及的資源問題，但針對當(dāng)前白及人工栽培中存在的生產(chǎn)技術(shù)落后、管理粗放、育種滯后、種質(zhì)創(chuàng)新不足、資源破壞嚴(yán)重等問題，應(yīng)加強(qiáng)白及優(yōu)良品種選育，并系統(tǒng)開展規(guī)范化種植及野生資源撫育更新研究，從而推動其生產(chǎn)可持續(xù)健康發(fā)展，更好滿足市場需求。

參考文獻(xiàn)：

[1]周濤，江維克，李玲，等. 貴州野生白及資源調(diào)查和市場利用評價[J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，32（6）：28-30.

[2]張永為，蔣福升，王寅，等. 白及產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展的探討[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（10）：2264-2267.

[3]國家藥典委員會. 中國藥典：一部[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95.

[4]任華忠，何毓敏，楊麗. 白及化學(xué)成分其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（2）：134-140.

[5]趙艷霞，鄧雁如，張曉靜，等. 白及屬藥用植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（8）：1137-1145.

[6]管常東，葉靜，鄭曉君，等. 白芨組織快繁育苗技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 云南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，32（S1）：416-421.

[7]張燕，黎斌，李思鋒. 不同培養(yǎng)基上白芨的種子萌發(fā)與幼苗形態(tài)發(fā)生[J]. 西北植物學(xué)報，2009，29（8）：1584-1589.

[8]孟彪，苗桂林，許東東，等. 白及組培苗移栽技術(shù)研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，16（2）：56-58.

[9]古碧珠，劉柏濤，何嘉碧，等. 蘭花種子的原球莖誘導(dǎo)及其生長分化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（31）：13511-13513.

韋榮昌，馬小軍，閆志剛，等. 羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株遺傳背景的RAPD分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：241-243，293.endprint