芒萁葉斑病病原菌分離鑒定和生物學(xué)特性

謝美華等

摘要：對(duì)芒萁葉斑病進(jìn)行病原鑒定，研究病原菌生物學(xué)特性和殺菌劑對(duì)其抑制作用。結(jié)果表明，該病原菌為擬盤多毛孢屬真菌，最適宜生長的碳源為乳糖、氮源為硝酸鈉。菌絲適宜生長的溫度范圍較窄，只能在15～30 ℃范圍內(nèi)生長，28 ℃ 菌絲生長最好，分生孢子在32 ℃時(shí)萌發(fā)率最高；適宜菌絲和分生孢子生長和萌發(fā)的pH值范圍均較廣，適宜菌絲生長的pH值為4.0，適宜分生孢子萌發(fā)的pH值為6.0；光周期對(duì)菌落生長的影響不大，光照有利于分子孢子的萌發(fā)。供試殺菌劑中以百菌清抑菌效果最好。

關(guān)鍵詞：芒萁；葉斑??；病原鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S435.67文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0130-04

收稿日期：2014-02-25

基金項(xiàng)目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃（編號(hào)：2011FZ186）；云南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃；楚雄師范學(xué)院科研基金（編號(hào)：10YJYB02）；楚雄師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：2013cxcy04）。

作者簡介：謝美華（1981—），女，云南楚雄人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事植物病理學(xué)真菌病害研究。E-mail：xiemeihua@cxtc.edu.cn。

通信作者：楊海艷，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事植物病理學(xué)真菌病害研究。Tel：（0878）3100784；E-mail：haiyanyang@cxtc.edu.cn。芒萁[Dicranopteris dichotomya （Thunb. ） Bernh.]是多年生常綠蕨類植物，廣泛分布于中國長江以南各省區(qū)、朝鮮南部及日本，是酸性土壤指示植物，有藥用價(jià)值[1]。在自然狀態(tài)下，芒萁的種間競爭力極強(qiáng)，芒萁的化感物質(zhì)釋放到周圍環(huán)境，抑制并排擠其他植物的生長發(fā)育，從而形成單優(yōu)勢(shì)的“純植叢”群落[2]。近年來，關(guān)于芒萁的研究主要集中在生理生化指標(biāo)的測(cè)定[3-4]、化感作用[5-9]、多糖和黃酮提取[9-11]等方面，但對(duì)芒萁葉斑病的研究目前還未見報(bào)道。本研究選取芒萁葉斑病病葉，對(duì)該病害進(jìn)行分離鑒定和生物學(xué)特性研究，以期為芒萁葉斑病控制和防治方面提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病原菌的分離

自楚雄彝族自治州西山公園采集到9組芒萁葉斑病的病葉進(jìn)行培養(yǎng)，共分離到3個(gè)菌株，其中，1株是交鏈孢屬菌株，1株是黑曲霉屬菌株，1株是擬盤多毛孢屬菌株。將純培養(yǎng)得到的3個(gè)菌株孢子懸浮液接種到健康的芒萁葉片上，每組設(shè)24個(gè)重復(fù)。10 d后，接種了交鏈孢屬和黑曲霉屬的植株依然健康，而接種了擬盤多毛孢屬菌株的植株出現(xiàn)了葉斑病。從接種發(fā)病的芒萁植株上再分離到的純培養(yǎng)，性狀與接種物相同。從而推測(cè)其為芒萁葉斑病的病原，菌株編號(hào)為mangqi01。

1.2病原菌的鑒定

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定純化分離到的病原菌，利用顯微鏡進(jìn)行觀察，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.2病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增和分析用CTAB法提取病原菌全基因組DNA，進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，反應(yīng)各成分終濃度為：Taq酶0.02 U/μL；引物 0.4 μmol/L；DNA 模板20 ng/μL；dNTPs 0.4 μmol/L；2× PCR反應(yīng)緩沖液。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性，3 min； 94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃復(fù)性45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京百泰克生物技術(shù)有限公司測(cè)序，所得序列在NCBI上比對(duì)，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1軟件采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3生物學(xué)特性研究[12-13]

1.3.1不同碳源和氮源對(duì)菌落生長的影響以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分別以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每種培養(yǎng)基中分別接種直徑為5 mm的菌塊，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.2不同溫度對(duì)菌落和分子孢子萌發(fā)的影響取直徑為5 mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45 ℃黑暗下恒溫培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3不同pH值對(duì)菌落和分子孢子萌發(fā)的影響將高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、80、9.0、10.0、10.9倒平板，取直徑5 mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，黑暗條件下25 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。用0.2 mol/L磷酸氫二鈉和0.2 mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、100、10.9，置于25 ℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，24 h后鏡檢萌發(fā)率，每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4不同光照處理取直徑為5 mm的菌塊接種于察氏培養(yǎng)基中央，分別置于24 h光照、光-暗周期12 h-12 h、24 h 黑暗環(huán)境中，25 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液，滴于載玻片上，培養(yǎng)條件同菌落培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每次鏡檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4不同殺菌劑對(duì)菌落生長的影響

將代森錳鋅、百菌清、敵克松、霜·錳鋅和撲海因用無菌水按其常用倍數(shù)稀釋，每10 mL培養(yǎng)基中加入1 mL藥液制成含藥液的平板，對(duì)照組加入等量無菌水。取5 mm菌塊置于察氏培養(yǎng)基平板中央，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1芒萁病原菌的鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定該病主要發(fā)生在葉部，發(fā)病初期，葉緣、葉脈出現(xiàn)灰色、灰黑色小斑點(diǎn)；中期小斑點(diǎn)擴(kuò)大成不規(guī)則灰色輪紋，其上著生黑色斑點(diǎn)，并伴有葉黃化、卷曲等癥狀，病情嚴(yán)重時(shí)整個(gè)葉片枯萎掉落。PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d后菌落直徑6 cm，隆起，菌絲白色、絮狀，直徑1.5 cm處有明顯的輪紋，反面杏色，直徑1.5 cm處出現(xiàn)深杏色輪紋，且輪紋上的培養(yǎng)基呈輻射形開裂；菌絲生長速度快，28 ℃培養(yǎng)5 d后菌落直徑為5 cm；長滿全皿，正面白色，不均勻分布黃褐色菌絲，反面出現(xiàn)深褐色不規(guī)則小圓點(diǎn)；培養(yǎng)10 d，正面不均勻分布透明水滴及黑色油滴，反面均勻分布深褐色圓點(diǎn)，不均勻分布黑點(diǎn)（圖1）。分生孢子5細(xì)胞，多為竹節(jié)狀或棒狀，少數(shù)為紡錘形，直立或彎曲，向基部漸尖；中間3色胞異色型，第1、2色胞褐色，梯形，第2色胞外壁加厚，第3色胞淺褐色，半透明，分隔處縊縮或不縊縮；頂胞多為長梯形或圓柱形，少數(shù)為三角形，透明，具側(cè)生式頂端附屬絲1～3根，多為2根；基部細(xì)胞圓錐形或錐形，不具或只具中生式基部附屬絲1根；大小（3.7～5.9）×（4.2～6.7） μm（平均3.95×6.3 μm）（圖2、圖3）。

2.1.2病原菌rDNA-ITS序列分析將mangqi01菌株的5.8S rDNA-ITS序列在NCBI里進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示mangqi01與Pestalotiopsis sp.、Pestalotiopsis oxyanthi、Pestalotiopsis foedans、Pestalotiopsis clavispora、Pestalotiopsis ixorae和Pestalotiopsis mangiferae同源性最高，下載它們的序列，以Pestalotia cinchonae和Pestalotia subcuticularis為外群，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1軟件采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）表明，與其遺傳距離較近的有6個(gè)種，屬內(nèi)節(jié)點(diǎn)支持率為0.96，結(jié)合其形態(tài)特征的觀察研究，供試菌株mangqi01為腔孢綱（Coelomycetes）黑盤孢目（Melanconiale）擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis Stey.）[14-16]，病原菌的種待定。

2.2不同氮源和碳源對(duì)mangqi01菌落生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異。最適該菌生長的氮源是硝酸鈉，與硫酸銨、硝酸銨、L-苯丙氨酸、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨作氮源差異極顯著。最適該菌生長的碳源是乳糖，與可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖差異不顯著；與D-半乳糖、D-果糖和甘油差異極顯著（表1）。

2.3不同光照對(duì)mangqi01菌株生長的影響

通過24 h光照、12 h光/暗交替、無光照培養(yǎng)，有無光照對(duì)菌落的生長影響差異不顯著。光照條件下分生孢子萌發(fā)率最高，與12 h光/黑影響無顯著差異，與黑暗條件培養(yǎng)達(dá)到極顯著差異（表2）。

2.4不同溫度對(duì)mangqi01菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，該病原菌生長適應(yīng)的溫度范圍較窄，只能在15～30 ℃范圍內(nèi)生長 最適的生長溫度是28 ℃，與25 ℃

2.5不同pH值對(duì)mangqi01菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲和分生孢子萌發(fā)適應(yīng)的pH值范圍較廣，在pH值2.5～10.9之間均能生長和萌發(fā)。該菌菌絲在酸性條件下長得較好，pH值4時(shí)菌絲生長最快，與pH值9、 pH值10和pH值10.9差異極顯著；與其他處理差異不顯著。pH值6.0時(shí)孢子萌發(fā)率最高，pH值6.0時(shí)孢子萌發(fā)率與與其他處理差異極顯著（表4）。

2.5不同殺菌劑對(duì)菌落生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，5種廣譜殺菌劑對(duì)該菌的生長均有抑制作用（圖5）。百菌清對(duì)該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、代森錳鋅、霜·錳鋅，效果最差的是敵克松。百菌清的抑菌效果與撲海因和代森錳鋅無顯著差異，與霜·錳鋅和敵克松差異極顯著。

3結(jié)論與討論

3.1病原菌的分離鑒定

芒萁繁殖力極強(qiáng)，生長發(fā)育旺盛，種間競爭力強(qiáng)而排擠其他植物種類的生長與分布，因此在植物群落下層連續(xù)成片分布，形成單優(yōu)層片[17]，從而使病害更容易傳播蔓延。目前，還未見對(duì)芒萁葉斑病病原菌的報(bào)道。本研究通過對(duì)芒萁葉斑病病原菌進(jìn)行分離純化，利用形態(tài)學(xué)特征觀察并結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行分析鑒定[18]，結(jié)果表明，兩者的鑒定結(jié)果相互吻合，初步推測(cè)病原菌為擬盤多毛孢屬真菌。

3.2病原菌生物學(xué)特性

本研究結(jié)果表明，該菌對(duì)供試的7種氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異，最適該菌生長的氮源是硝酸鈉，最適該菌生長的碳源是乳糖。該病原菌適宜生長的溫度范圍較窄，只能在15～30 ℃范圍內(nèi)生長，最適的生長溫度是28 ℃，在10 ℃以下、32 ℃及以上溫度條件下停止生長；該病原菌孢子在5～45 ℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)；有無光照對(duì)菌落生長無顯著影響，光照有利于分子孢子的萌發(fā)；適宜菌絲和分生孢子生長和萌發(fā)的pH值范圍均較廣，菌絲適宜生長的pH值為4.0，分生孢子適宜萌發(fā)的pH值為6.0。

3.3廣譜殺菌劑對(duì)該菌生長的影響

在本研究中5種廣譜殺菌劑對(duì)該菌落的生長均有抑制作用。百菌清對(duì)該菌的抑制效果最好，隨后依次是撲海因、代森錳鋅、霜·錳鋅，效果最差的是敵克松。該菌的生物學(xué)特性試驗(yàn)都是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的，相對(duì)于自然生長時(shí)復(fù)雜的生長環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境相對(duì)單一，要確定該病害的生物學(xué)特性，哪種殺菌劑對(duì)該菌的抑制作用最好，還有待開展大田試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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