大容量雙肺灌洗對(duì)煤塵肺患者免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響

張洪亮++范華東++陸華東

[摘要] 目的 分析大容量雙肺灌洗（Massive whole-lung lavage，MWLL）對(duì)煤塵肺患者免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響，為煤塵肺患者的治療提供依據(jù)。 方法 對(duì)70例煤塵肺患者實(shí)施MWLL治療，共灌洗10～15次，治療前、治療后采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Clara細(xì)胞分泌蛋白-10（CC-10）、轉(zhuǎn)化因子-β1（TGF-β1），采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群。 結(jié)果 治療后Ⅰ期、Ⅱ期患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、TNF-α、TGF-β1、CC-10與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；Ⅲ期患者治療后CD4+、CD4+/CD8+比值、TNF-α、TGF-β1與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但治療前、后CD8+、CC-10比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 MWLL治療在短期內(nèi)能改善煤塵肺患者的體液免疫及細(xì)胞免疫。

[關(guān)鍵詞] 煤塵肺；大容量雙肺灌洗；T細(xì)胞亞群；細(xì)胞因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R472 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）01-0013-03

Massive whole-lung lavage impact on immune cells and cytokines in patients with pneumoconiosis

ZHANG Hongliang1 FAN Huadong1 LU Huadong2

1.Changguang Group Iimited Iiability Company Worker's Hospital，Huzhou 313117， China；2.Respiratory Department， Huzhou City Centre Hospital in Zhejiang Province，Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To analyze MWLL impact on immune cells and cytokines in patients with pneumoconiosis，and to provide the basis for coal pneumoconiosis patients. Methods 70 cases of pneumoconiosis implement MWLL treatment of lavage 10 to 15 times，by enzyme-linked immunosorbent assay of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α），Clara cell secretory protein 10（CC-10），transforming growth factor-β1（TGF-β1），the use of flow cytometry in peripheral blood T cell subsets before and after treatment. Results CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ratio，TNF-α，TGF-β1，CC-10 of periodⅠ，Ⅱpatients，the difference was statistically significant after treatment compared with before treatment （P<0.05 or P<0.01）； CD4+，CD4+/CD8+ratio，TNF-α，TGF-β1 of period Ⅲ patients，the difference was statistically significant after treatment compared with before treatment（P<0.05，but the difference of CD8+，CC-10 was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion MWLL treatment can improve coal pneumoconiosis humoral and cellular immunity in the short term.

[Key words] Coal pneumoconiosis； Lavage lung capacity； T cell subsets； Cytokine

煤塵肺多因患者長(zhǎng)期暴露在高粉塵環(huán)境中，煤塵堆積在肺內(nèi)所致[1]。然而，臨床對(duì)于煤塵肺的具體發(fā)病機(jī)制目前尚無(wú)定論，可能與煤塵堆積引發(fā)的細(xì)胞免疫紊亂及炎性反應(yīng)有關(guān)[2]。大容量雙肺灌洗（MWLL）最早是用于治療肺泡蛋白沉著癥，其通過(guò)清除沉著的蛋白而改善患者體液免疫及細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而達(dá)到治療的目的。本文對(duì)70例煤塵肺患者實(shí)施MWLL治療，分析其對(duì)患者T免疫細(xì)胞亞群及與煤塵肺相關(guān)的細(xì)胞因子的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月～2014年1月到長(zhǎng)廣醫(yī)院就治的煤塵肺患者70例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)》（GBZ70-2009）中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并經(jīng)高仟伏X射線胸片檢查確診；②符合MWLL治療指征；③接觸煤塵、巖塵、混合粉塵的混合性或單純塵肺患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>65歲；②心肺功能低下、凝血功能障礙、伴有嚴(yán)重支氣管畸形者；③伴有活動(dòng)性肺結(jié)核者；④近2周有肺部感染、哮喘表現(xiàn)。70例均為男性，其中Ⅰ期28例，年齡35～59歲，平均（51.3±8.2）歲；接觸粉塵年限10～32年，平均（22.1±7.7）年；Ⅱ期32例，年齡32～60歲，平均（50.7±8.1）歲；接觸粉塵年限8～33年，平均（22.5±7.5）年；Ⅲ期10例，年齡30～57歲，平均（51.2±8.3）歲；接觸粉塵年限7～34年，平均（22.6±7.8）年。三組一般資料比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 MWLL方法

70例均在靜脈復(fù)合麻醉下實(shí)施MWLL治療。患者取平臥位或取灌洗側(cè)居上斜臥位（25°～30°），連接Solar多功能監(jiān)護(hù)儀，將雙腔支氣管導(dǎo)管（RoberFshaw 管）插入患者支氣管及氣管，確認(rèn)雙肺隔離滿(mǎn)意后，一側(cè)肺給予純氧通氣，另一側(cè)采用細(xì)支氣管鏡檢查確定球囊定位良好后開(kāi)始灌洗，一般先右后左。在灌洗前將灌洗液加溫至37℃，首次灌洗500 mL，觀察患者心電圖、血氧飽和度等無(wú)異常則反復(fù)灌洗。根據(jù)肺容量每次灌入量1000～2000 mL，隨后負(fù)壓4～5 kPa吸出等量的肺灌洗液，于第3、6、9次負(fù)壓吸出灌洗液末給予加壓純氧通氣，加壓最大壓力<4 kPa，負(fù)壓吸出與正壓通氣要交替進(jìn)行，反復(fù)灌洗[4]。一側(cè)灌洗結(jié)束后，待殘留液基本吸收，患者呼吸基本恢復(fù)、肺順應(yīng)性接近灌洗前水平，生命體征平穩(wěn)后，以相同方法換另一側(cè)灌洗，雙肺共灌洗10～15次，直至灌洗回收液變清亮為止，一般一側(cè)灌洗次數(shù)<12次。

1.3 檢測(cè)方法

治療前2 d及MWLL灌洗結(jié)束后2 d分別抽取空腹靜脈血4 mL。取2 mL靜脈血置于EDFA抗凝管中，采用Beckman流式細(xì)胞儀（美國(guó)生產(chǎn)）檢測(cè)F淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+占細(xì)胞總數(shù)的比例，并計(jì)算兩者的比值。試劑購(gòu)于美國(guó)BD公司，采用CD4+FITC、CD8+PE鼠抗人熒光標(biāo)記抗體。再取2 mL進(jìn)行3000 r/min離心處理10 min，取上層血清，置于-20℃冰箱中保存。12 h內(nèi)采用雙抗酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Clara細(xì)胞分泌蛋白-10（CC-10）、轉(zhuǎn)化因子-β1（TGF-β1）。儀器為ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)生產(chǎn)），試劑盒購(gòu)于深圳晶美生物工程有效公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前、后免疫細(xì)胞變化

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療后CD4+、CD4+/CD8+比值高于治療前，Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CD8+低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Ⅲ期患者CD8+治療前、后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 治療前、后細(xì)胞因子變化

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療后TNF-α高于治療前，TGF-β1顯著低于治療前；Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CC-10高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但Ⅲ期患者CC-10治療前、后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

我國(guó)是煤塵肺的高發(fā)地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)煤塵肺患者約有100萬(wàn)人，占全世界的50%以上，而且每年新增600例以上[5]，對(duì)患者生活質(zhì)量及生存帶來(lái)巨大威脅。

煤塵沉積引發(fā)煤塵肺的機(jī)制復(fù)雜，但其病因明確。粉塵滯留在毛細(xì)支氣管及肺泡上引發(fā)炎癥反應(yīng)及吞塵使巨噬細(xì)胞增加是煤塵肺的主要致病因素[6]。Toru等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在煤塵肺進(jìn)展過(guò)程中，有大量的活性介質(zhì)及細(xì)胞因子參與，同時(shí)伴有免疫功能失衡。Rong等[8]研究報(bào)道，在煤塵肺進(jìn)展過(guò)程中，各種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子表現(xiàn)出不同的變化，最典型的是TNF-α下降、TGF-β1升高、白細(xì)胞介素-6（IL-6）升高。同時(shí)T細(xì)胞亞群在數(shù)量及比例上也有所改變，如CD4+下降，CD8+升高，CD4+/CD8+下降等。本研究中煤塵肺患者治療前均伴有TNF-α下降，F(xiàn)GF-β1升高，CD4+下降， CD8+升高，CD4+/CD8+下降等表現(xiàn)，尤其是Ⅲ期患者上述細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞變化更明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，證實(shí)在煤塵肺進(jìn)展中伴有免疫功能及細(xì)胞因子失調(diào)。

MWLL最早是用于治療肺泡蛋白沉著癥[9]，由于其能有效清除殘留在肺泡內(nèi)的粉塵、炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等而在煤塵肺的治療中廣泛適用，但其治療機(jī)制目前尚未明確，臨床推測(cè)其可能通過(guò)改善機(jī)體免疫功能及糾正細(xì)胞因子紊亂而實(shí)現(xiàn)治療目的[10]。煤塵肺患者肺泡內(nèi)大量沉積的難溶性煤塵對(duì)巨噬細(xì)胞有毒性作用，導(dǎo)致肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡，使得TNF-α合成及釋放減少，嚴(yán)重影響機(jī)體免疫功能。Steffen等[11]研究報(bào)道，MWLL可將沉積在肺泡內(nèi)的沉渣、粉塵清除，機(jī)體內(nèi)環(huán)境得到改善，TNF-α的釋放增加。我國(guó)學(xué)者蔚巖等[12]研究得到相同的結(jié)論，機(jī)體吸入大量的粉塵后，粉塵直接損傷Clara細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，使得CC-10蛋白、TNF-α的合成及釋放減少，隨著機(jī)體粉塵的清除，CC-10、TNF-α的含量逐漸上升。本研究中Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CC-10、TNF-α均有明顯上升，提示MWLL可糾正機(jī)體細(xì)胞因子紊亂。TGF-β1是肺部纖維化發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)上調(diào)纖維粘連蛋白與膠原蛋白基因的表達(dá)而降低蛋白酶的分泌，從而參與塵肺的纖維化進(jìn)程[13]。本研究中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療前TGF-β1顯著升高，尤其是Ⅲ期患者的TGF-β1含量是普通人的3倍。張志平等[14]研究認(rèn)為，煤塵肺患者TGF-β1含量升高的原因是粉塵中含有大量的SiO2，SiO2可激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)物質(zhì)，其中包括TGF-β1，進(jìn)而促進(jìn)膠原纖維纖維化進(jìn)程。本研究中，治療后Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者TGF-β1顯著低于治療前（P<0.05），可能與MWLL將沉積在肺內(nèi)的SiO2清除有關(guān)。

國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)，煤塵堆積在肺泡內(nèi)損傷巨噬細(xì)胞，一方面可促進(jìn)炎性細(xì)胞的釋放而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；另一方面可釋放一種強(qiáng)烈的內(nèi)源性免疫抑制劑前列腺素 E2（PEG2），使T細(xì)胞免疫功能癱瘓[15]。本研究中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療前CD4+下降，CD8+升高，CD4+/CD8+下降，免疫功能受到一定抑制。MWLL治療后，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治療后CD4+、CD4+/CD8+比值高于治療前，Ⅰ期、Ⅱ期患者治療后CD8+低于治療前（P<0.05），與Ga■Fane等[16]報(bào)道基本相符，證實(shí)MWLL可改善煤塵肺患者的細(xì)胞免疫功能。

值得注意的是，由于晚期煤塵肺（Ⅲ期）患者肺纖維化程度嚴(yán)重，臨床認(rèn)為晚期煤塵肺患者洗肺治療的收效甚微，往往放棄洗肺治療。本研究中，Ⅲ期患者經(jīng)過(guò)MWLL治療后，T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子的變化雖然沒(méi)有Ⅰ期、Ⅱ期患者的明顯，或所需的療程較長(zhǎng)，但治療后TNF-α、TGF-β1、CD4+、CD4+/CD8+比值與治療前比較有顯著差異（P<0.05），提示對(duì)Ⅲ期煤塵肺患者進(jìn)行全肺灌洗的重要性。

綜上所述，MWLL治療在短期內(nèi)能改善煤塵肺患者的體液免疫及細(xì)胞免疫。

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（收稿日期：2014-06-05）