垂體腺瘤組織中NF-κB、MMP-9、MICA的表達(dá)變化及意義

陳正，常映薇，李珍珠，孫其凱，王清波，李澤福(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州56600；濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)校區(qū))

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·論著·

垂體腺瘤組織中NF-κB、MMP-9、MICA的表達(dá)變化及意義

陳正1，常映薇2，李珍珠1，孫其凱1，王清波1，李澤福1(1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256600；2濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)校區(qū))

摘要：目的觀察垂體腺瘤組織中NF-κB、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、MHC-Ⅰ類鏈分子相關(guān)抗原A(MICA)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法采用免疫組化法對(duì)垂體腺瘤組織和正常腦組織中的NF-κB蛋白、MMP-9蛋白及MICA蛋白進(jìn)行檢測(cè)；采用qRT-PCR法對(duì)垂體腺瘤組織及正常腦組織中的NF-κB mRNA、MMP-9 mRNA、MICA mRNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 垂體腺瘤與正常腦組織中NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%(40/40)、30%(6/20)，MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%(40/40)、15%(3/20)，MICA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%(40/40)、0；兩組比較，P均<0.01。垂體腺瘤與正常腦組織中NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為13.045±6.200、2.040±2.067，MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為28.770±7.661、2.369±1.460，MICA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為231.817±41.046、5.062±3.849；兩組比較，P均<0.05。NF-κB蛋白與MICA蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.368、0.345,P均<0.05)。結(jié)論NF-κB、MMP-9及MICA在垂體腺瘤組織中高表達(dá)，NF-κB可能通過(guò)促進(jìn)MMP-9及MICA表達(dá)而促進(jìn)垂體腺瘤發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞：垂體瘤；MHC-Ⅰ類鏈分子相關(guān)抗原A；基質(zhì)金屬蛋白酶9；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

垂體腺瘤來(lái)源于上皮腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，是一個(gè)涉及多基因、多階段的復(fù)雜變化過(guò)程。NF-κB是重要的一種核轉(zhuǎn)錄因子，作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑的中樞，參與炎癥、免疫、細(xì)胞增殖及凋亡等多種過(guò)程的基因調(diào)控[1]，可上調(diào)包括MHC-Ⅰ類鏈分子相關(guān)抗原A (MICA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等在內(nèi)的多種蛋白表達(dá)。MICA作為非經(jīng)典HLAⅠ類分子, 在多數(shù)上皮性腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)[2]，MICA蛋白在體內(nèi)有兩種存在形式，即位于細(xì)胞膜表面的膜型MICA蛋白(mMICA)和被分泌入腫瘤微環(huán)境及血液中的分泌型MICA蛋白(sMICA)[3]。sMICA可由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水解mMICA產(chǎn)生[4]。mMICA與NKG2D結(jié)合可介導(dǎo)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，而sMICA與NKG2D結(jié)合可抑制NKG2D在NK細(xì)胞的表達(dá),不僅降低了NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，還導(dǎo)致NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力降低，從而使腫瘤發(fā)生免疫逃逸[5]。MMP-9是MMPs家族的一種重要明膠酶，是降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶[6]，同時(shí)MMP-9參與MICA-NKG2D的腫瘤免疫逃逸過(guò)程。本研究觀察了垂體腺瘤組織中NF-κB、MMP-9、MICA的表達(dá)變化，并探討其意義。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料2011年6月～2013年12月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科收治的垂體腺瘤患者40例(觀察組)，男24例、女16例，年齡25～78歲。患者均無(wú)免疫相關(guān)性疾病，術(shù)前未使用免疫抑制類藥物。均經(jīng)病理檢查確診。組織學(xué)類型為泌乳素型垂體腺瘤。40例患者均接受手術(shù)切除并留取腫瘤組織。另取10例高血壓腦水腫患者因腦出血需顱內(nèi)減壓手術(shù)的正常腦組織作為對(duì)照組。該研究征得濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2NF-κB、MMP-9、MICA蛋白檢測(cè)方法采用免疫組化法。兔抗人NF-κB(Cell Signaling)，兔抗人MICA(abcam)，兔抗人MMP-9(abcam)，羊抗兔二抗(武漢博士德公司)。RNA提取試劑，逆轉(zhuǎn)錄酶，dNTP，Taq DNA聚合酶(TAKARA公司)。所有標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，室溫下，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，蒸餾水洗3次，0.01 mol/L檸檬酸鈉(pH 6.0)抗原修復(fù)液微波修復(fù)抗原，冷卻至室溫，PBS洗2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，然后滴加兔抗人NF-κB抗體(1∶800)，MICA(1∶100)，4 ℃過(guò)夜。按兔IgG免疫組化試劑盒SABC即用型滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃、30 min，PBS洗3次。滴加SABC，37 ℃、20 min，PBS洗4次。最后DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。MICA蛋白染色陽(yáng)性信號(hào)位于胞膜和胞質(zhì)，NF-κB蛋白定位于胞質(zhì)和胞核，MMP-9蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)。免疫組化染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色或褐黃色為2分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。兩個(gè)分值相加為免疫組化染色的最終評(píng)分，并按下述標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：0分為陰性(-)，2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中度陽(yáng)性(++)，5分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，+、++、+++判為陽(yáng)性。

1.3NF-κB、MMP-9、MICA mRNA檢測(cè)方法采用qRT-PCR法。按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取組織中的總RNA。cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL。NF-κB(p65)引物擴(kuò)增產(chǎn)物110 bp，上游引物5′-ACCCCTCCCTACGCAGAC-3′,下游引物5′-TTTCTCCTCAATCCGGTGAC-3′；MICA引物擴(kuò)增產(chǎn)物98 bp，上游引物：5′-AACCCTGACTGCACAGATCC-3′，下游引物：5′-ATCTTCCCTTTTGCACCTCC-3′；MMP-9引物擴(kuò)增產(chǎn)物166 bp，上游引物5′-ACGGCAGAGAGCATTGTGTA-3′，下游引物5′-CCTGTAGCGTAAGAGCCAGAG-3′；β-actin引物擴(kuò)增產(chǎn)物135 bp，上游引物：5′-CCAACTGGGACGACAT-3′,下游引物：5′-TCTGGGTCATCTTCTCG-3′(上海生工)。進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性30 s。PCR反應(yīng)：95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，融解曲線分析。以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算NF-κB、MMP-9、MICA mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1兩組NF-κB蛋白、MMP-9蛋白、MICA蛋白表達(dá)比較NF-κB(p65)蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞的胞質(zhì)，少量的細(xì)胞會(huì)有核染色，觀察組與對(duì)照組NF-κB(p65)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%(40/40)、30%(6/20)，MICA蛋白表達(dá)于胞質(zhì)和胞膜，MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%(40/40)、15%(3/20)，MICA蛋白表達(dá)于胞質(zhì)和胞膜，MICA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%(40/40)、0；兩組比較，P均<0.01。

2.2兩組NF-κB、MMP-9、MICA mRNA表達(dá)比較觀察組與對(duì)照組NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為13.045±6.200、2.040±2.067，MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為28.770±7.661、2.369±1.460，MICA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為231.817±41.046、5.062±3.849；兩組比較，P均<0.05。

2.3NF-κB蛋白、MICA蛋白與MMP-9蛋白表達(dá)的關(guān)系NF-κB蛋白與MICA蛋白、MMP-9蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.368、0.345,P均<0.05)。

3討論

NF-κB是由Rel/NF-κB家族的多肽成員組成的一組轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞受到外信號(hào)刺激后，IκB激酶復(fù)合體(IκB kinase IKK)活化將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定為位點(diǎn)。游離的NF-κB迅速移位至細(xì)胞核，與特異性κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[10]。近年來(lái)研究[11]表明，NF-κB與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NF-κB可以上調(diào)多種細(xì)胞因子表達(dá)，如腫瘤壞死因子[12]、基質(zhì)金屬蛋白酶[13]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[14]等。Lin等[15]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腫瘤壞死因子可上調(diào)人內(nèi)皮細(xì)胞表面的免疫配體MICA，這種激活上調(diào)被控制在轉(zhuǎn)錄水平，是由130 bp MICA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的一個(gè)位點(diǎn)控制，這個(gè)位點(diǎn)能使NF-κB通路和熱休克通路在NF-κB蛋白活化時(shí)對(duì)細(xì)胞表面的MICA產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。另外，Molinero等[1]研究表明，MICA基因第1內(nèi)含子含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染NF-κB基因后能上調(diào)MICA蛋白表達(dá)，而NF-κB抑制劑PDTC能抑制MICA蛋白表達(dá)，這說(shuō)明MICA可能是NF-κB的下游基因。另外，研究[1，16]發(fā)現(xiàn)，MAPK通路、DNA損傷反應(yīng)通路均能調(diào)控MICA基因表達(dá)，而這些通路的活化都能激活NF-κB表達(dá)，這表明NF-κB可能通過(guò)多條通路對(duì)MICA基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。本研究中，垂體腺瘤組織中的NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常腦組織。提示NF-κB可能是垂體腺瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。有關(guān)NF-κB在垂體腺瘤中的作用機(jī)制尚不清楚，目前研究顯示NF-κB可能通過(guò)調(diào)控MICA及MMP-9對(duì)垂體腺瘤產(chǎn)生影響。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是蛋白水解酶中最重要的金屬酶之一，通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織侵襲，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡等[17]。MMP-9在其啟動(dòng)子區(qū)含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，是NF-κB的下游基因，與組織發(fā)生、傷口愈合及腫瘤的侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。Turner等[19]發(fā)現(xiàn)，在侵襲性垂體腺瘤中MMP-9的表達(dá)明顯高于非侵襲性垂體腺瘤，推測(cè)MMP-9表達(dá)可能與垂體腺瘤的復(fù)發(fā)跟侵襲性有關(guān)。近年研究證實(shí)，在口腔鱗癌[20]、人骨肉瘤[21]以及結(jié)腸癌[22]等腫瘤細(xì)胞中，MMP-9能使MICA蛋白脫落水解形成sMICA，從而使腫瘤進(jìn)行免疫逃逸，說(shuō)明MMPs對(duì)MICA蛋白的水解脫落起重要作用。MICA蛋白在體內(nèi)有兩種存在形式，即位于細(xì)胞膜表面的模型MICA蛋白(mMICA)和被分泌入腫瘤微環(huán)境及血液中的分泌型MICA蛋白(sMICA)。在多數(shù)腫瘤中，雖然總的MICA(包括mMICA與sMICA)表達(dá)上調(diào)，但其固有免疫仍處于抑制狀態(tài)。其原因在于mMICA脫落成為sMICA，并且sMICA與NKG2D結(jié)合后抑制了NKG2D在NK細(xì)胞的表達(dá),不僅降低了NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，還導(dǎo)致分泌細(xì)胞因子的能力降低，促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸。本研究中，MMP-9在垂體腺瘤的表達(dá)明顯高于正常組織，垂體腺瘤患者外周血清中MMP-9、sMICA水平明顯高于正常人。我們推測(cè)在垂體腺瘤中MMP-9可促進(jìn)MICA蛋白水解脫落為sMICA，并且MICA與MMP-9均是受NF-κB調(diào)控的靶基因，垂體腺瘤中的MICA、MMP-9表達(dá)可能也受NF-κB的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，NF-κB表達(dá)與MMP-9表達(dá)與有明顯的正相關(guān)性，NF-κB表達(dá)與MICA的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，我們推測(cè)在垂體腺瘤中，NF-κB的活化一方面促使MICA蛋白高表達(dá)，一方面誘導(dǎo)MMP-9高表達(dá)來(lái)水解MICA蛋白，使其脫落為sMICA，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。NF-κB、MMP-9、MICA三者的共同作用對(duì)垂體腺瘤的發(fā)展起到重要作用。MICA-NKG2D在機(jī)體抗腫瘤免疫中起到了重要作用，如何提高免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的NKG2D受體密度及提高腫瘤細(xì)胞表面MICA蛋白的表達(dá)，并且抑制MICA蛋白脫落形成sMICA成為避免腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的一條新路徑。本研究為NF-κB可能對(duì)垂體腺瘤中MICA蛋白的表達(dá)及脫落的調(diào)控作用這一設(shè)想提供了組織學(xué)基礎(chǔ)，我們將繼續(xù)在細(xì)胞水平對(duì)這一設(shè)想進(jìn)行驗(yàn)證。

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Expression and significance of NF-kappa B, MMP-9, MICA in pituitary adenoma tissues

CHENZheng1, CHANG Ying-wei, LI Zhen-zhu, SUN Qi-kai, WANG Qing-bo, LI Ze-fu

(1AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalCollege,Binzhou256600)

Abstract:Objective The aim of this study was to examine the expression levels of NF-κB, MMP-9, and MICA and to explore its significance. MethodsWe examined the association between NF-κB, MMP-9, and MICA by immunohistochemical staining, Quantitative real-time PCR. ResultsThe positive rate of NF-κB were 100%(40/40), 30%(6/20)in pituitary adenomas and normal brain tissue. The positive rate of MMP-9 were 100%(40/40),15%(3/20)in pituitary adenomas and normal brain tissue. The positive rate of MICA were 100%(40/40), 0 in pituitary adenomas and normal brain tissues(P<0.05). Relative to express the NF-κB mRNA were 13.045±6.2, 2.04±2.067 in pituitary adenomas and normal brain tissues. Relative to express the MMP-9 mRNA were 28.77±7.661, 2.369±1.46 in pituitary adenomas and normal brain tissues. Relative to express the MICA mRNA were 231.817±41.046, 5.062±3.849 in pituitary adenomas and normal brain tissues(P<0.05). The expression levels of NF-κB, MMP-9, and MICA were positively related in patients with pituitary adenomas (r=0.368，0.345,P<0.05). ConclusionsNF-κB, MMP-9, and MICA are highly expressed in pituitary adenomas tissues. High levels of NF-κB by promoting the expression of MMP-9 and MICA promote the development of pituitary adenomas.

Key words:Pituitary adenomas；MHC- Ⅰ kind of chain molecules related antigen A；matrix metalloproteinase 9；nuclear transcription-κB

(收稿日期：2014-10-21)

通信作者簡(jiǎn)介：李澤福(1969-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)榇贵w瘤的免疫治療。E-mail：lizefu163@163.com

作者簡(jiǎn)介：第一陳正(1988-)，男，在讀研究生，研究方向?yàn)榇贵w瘤的免疫治療。E-mail：wide6087235@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171119)。

中圖分類號(hào)：R736.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)03-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.001