白藜蘆醇對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷的治療作用及機(jī)制

周繼紅，韋曉謀，陳宏，蘭慧慧，鄭妮，李金萬(wàn)(柳州市工人醫(yī)院，廣西柳州 545005)

白藜蘆醇對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷的治療作用及機(jī)制

周繼紅，韋曉謀，陳宏，蘭慧慧，鄭妮，李金萬(wàn)(柳州市工人醫(yī)院，廣西柳州 545005)

摘要：目的觀察白藜蘆醇(Res)對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷(ALI)的治療作用，并探討其可能的機(jī)制。方法60只Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、膿毒癥組(Sep組)、Res組各20只。Sep組和Res組采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)制備膿毒癥相關(guān)性ALI大鼠模型，Sham組除不作環(huán)形結(jié)扎和針刺穿孔外，其余操作均與Sep、Res組相同。各組大鼠術(shù)畢均皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。造模1 h后，Res組大鼠股靜脈注射40 mg/kg的Res液2 mL，Sham、Sep組給予等量生理鹽水。各組在造模后2、6、12、24 h分別采用頸椎脫臼處死5只大鼠，取大鼠肺組織，HE染色觀察其病理形態(tài)，RT-PCR法檢測(cè)肺組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll樣受體4(TLR4)mRNA，Western blotting法檢測(cè)HMGB1、TLR4蛋白。結(jié)果與Sep組相比，Res組造模后12 h肺組織病理變化有所減輕；造模后24 h各種病理改變明顯減輕，部分肺組織開(kāi)始接近正常形態(tài)。與Sep組相比，Res組造模后2、6、12、24 h肺組織HGMB1、TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論Res可以減輕大鼠膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)肺組織HGMB1和TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；膿毒癥；急性肺損傷；高遷移率族蛋白B1；Toll樣受體4

膿毒癥是在全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)基礎(chǔ)上合并的感染，常導(dǎo)致全身重要臟器發(fā)生嚴(yán)重病理、生理改變，是現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)面臨的難題，伴有膿毒癥休克及多器官功能障礙的患者病死率可高達(dá)80%～90%[1]。在膿毒癥并發(fā)的器官損傷中，肺是受損最嚴(yán)重的器官，主要表現(xiàn)為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征。白藜蘆醇(Res)是虎杖的根莖提取物，屬于非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等生物學(xué)活性，可下調(diào)各種炎癥介質(zhì)的合成和分泌[2~4]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是膿毒癥致病的晚期關(guān)鍵性因子，Toll樣受體4(TLR4)作為HMGB1的重要受體參與HMGB1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。本研究觀察了Res對(duì)膿毒癥大鼠ALI的治療作用，并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，13～15周齡，體質(zhì)量200～250 g，共60只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(桂2013-0008)。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、膿毒癥組(Sep組)和Res組，每組20只。Sep、Res組根據(jù)Rittirsch等[6]定義的盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(CLP)的標(biāo)準(zhǔn)化程序制備膿毒癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停晕彀捅韧租c(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后以碘伏常規(guī)消毒腹部區(qū)域，剃去腹部毛發(fā)，鋪無(wú)菌洞巾，沿腹正中線作一長(zhǎng)約1 cm縱行切口，以無(wú)菌鑷探查并暴露盲腸，在距盲腸末端約1 cm處結(jié)扎盲腸，以27號(hào)針頭垂直盲腸腸管貫通穿刺3次并擠出少量腸內(nèi)容物至腹腔內(nèi)，將穿刺后的盲腸還納腹腔，逐層縫合，造模時(shí)間控制在10 min以內(nèi)。Sham組除不作環(huán)形結(jié)扎和針刺穿孔外，其余操作均與Sep、Res組相同。各組大鼠術(shù)畢均給予皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。Sep組造模后1 h股靜脈注射生理鹽水2 mL；Res組股靜脈注射40 mg/kg的Res(購(gòu)自廣東廣弘藥材有限公司，并由廣西醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定室鑒定為正品)2 mL。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本收集及處理各組大鼠在造模后2、6、12、24 h分別頸椎脫臼處死5只大鼠，取右下肺組織，部分肺組織置于-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定HMGB1、TLR4 mRNA；部分肺組織用4%中性甲醛溶液固定，用于病理觀察。

1.3各組大鼠肺組織病理形態(tài)觀察取大鼠肺組織，常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片厚度3～4 μm，行HE染色，Olympus BX51顯微鏡觀察并采集圖像。

1.4各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。所有引物均由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成，設(shè)計(jì)軟件為Primer premer。取肺組織50 mg，每個(gè)待檢標(biāo)本設(shè)3個(gè)平行孔，按TRIzol法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果由ABI 500 PCR儀自動(dòng)生成，計(jì)算HMGB1、TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白檢測(cè)采用Western blotting法。取大鼠肺組織50 mg，按照試劑盒說(shuō)明提取總蛋白。取等質(zhì)量的樣本蛋白(30 μg)，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(初始電壓80 V，后改為100 V,各1 h)；將標(biāo)本蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上；TBST洗滌3次，每次5 min；加入TBST稀釋的一抗(兔抗HMGB1,1∶200稀釋；兔抗TLR4，1∶100稀釋)，4 ℃搖床過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10 min；加入熒光標(biāo)記的二抗工作液(1∶3 000)，室溫下避光振蕩1 h。TBST洗滌3次，每次10 min。用KODAK成像系統(tǒng)曝光獲取圖像，利用該成像儀綁定的軟件分析灰度值，進(jìn)行定量分析，以條帶灰度值的比值作為該組樣品蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠肺組織病理形態(tài)鏡下觀察可見(jiàn)，造模后2 h，各組大鼠肺組織均未見(jiàn)明顯異常。Sham組大鼠在6 h可見(jiàn)輕度灶性肺間質(zhì)或肺泡水腫，肺血管內(nèi)中性粒白細(xì)胞開(kāi)始聚集；12 h達(dá)高峰；24 h炎癥幾乎完全消退，但各時(shí)間點(diǎn)變化均較Sep組大鼠輕。Sep組大鼠在6 h可見(jiàn)肺組織重度炎性反應(yīng)，血管充血，間質(zhì)水腫出血，肺泡壞死，肺泡腔范圍消失，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；12 h達(dá)到高峰。Res組大鼠在12 h可見(jiàn)與Sep組相似的病理變化，但與Sep組相比有所減輕；24 h后肺組織炎性反應(yīng)病灶明顯減少，肺泡水腫、肺出血、肺實(shí)變和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。

2.2各組大鼠肺組織HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠肺組織HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與Sep組比較，△P<0.05，#P<0.01。

3討論

由肺外因素所致的ALI常常預(yù)示患者第一個(gè)器官功能障礙的開(kāi)始，其中非肺源性膿毒癥是最常見(jiàn)原因[7]。HMGB1具有“晚期”炎癥介質(zhì)的作用，參與膿毒癥的后期病理生理發(fā)展過(guò)程[8]。當(dāng)炎癥刺激細(xì)胞壞死或受損時(shí)，核內(nèi)的HMGB1可釋放到胞外，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等合成分泌促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等；而促炎因子又反過(guò)來(lái)促進(jìn)HMGB1的分泌，同時(shí)HMGB1和炎癥介質(zhì)互為誘導(dǎo)，正反饋瀑布式擴(kuò)大SIRS，并且在炎性反應(yīng)的后期，這種正反饋效應(yīng)對(duì)炎性反應(yīng)的維持起到了相當(dāng)重要的作用，引起多器官組織損傷，最終導(dǎo)致MODS。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)，HMGB1出現(xiàn)較晚，大量釋放約在炎癥暴發(fā)后20 h，持續(xù)20～72 h后降低，與其他早期炎性因子不同的是，出現(xiàn)較晚的HMGB1能為臨床提供較長(zhǎng)的窗口期來(lái)治療由它引發(fā)的重癥炎癥。TLR4作為HMGB1的重要受體參與HMGB1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，重組HMGB1誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞釋放致炎細(xì)胞因子，而使用TLR4中和抗體處理后致炎細(xì)胞因子釋放受到明顯抑制[11~13]。

Res對(duì)膿毒癥肺損傷具有治療作用，在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中，Res能明顯抑制肺部炎癥因子的釋放，減輕肺損傷程度[14,15]。在鼠類CLP誘導(dǎo)的大鼠膿毒癥模型中，腹腔內(nèi)給予Res能明顯減少肺部炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-6的產(chǎn)生，上調(diào)血紅素氧合酶1的表達(dá)，減輕肺部的病理性損傷[16]。Res的生物學(xué)活性為治療膿毒癥提供了新思路，多數(shù)報(bào)道[17~20]認(rèn)為其抗炎作用與其下調(diào)NF-κB和抑制TNF-α、IL-1β等早期炎癥因子有關(guān)，但Res對(duì)晚期炎癥介質(zhì)HMGB1及其重要受體TLR4表達(dá)的影響如何鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，相比于Sham組，Sep組肺組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，細(xì)胞大量凋亡和壞死，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加趨勢(shì)，至術(shù)后24 h達(dá)高峰后下降。Res組Res干預(yù)后在整體水平減輕了膿毒癥引起的ALI病理?yè)p傷，可以下調(diào)肺組織中HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達(dá)。結(jié)果提示Res可以影響HMGB1及TLR4的表達(dá)，減輕炎癥損傷及改善預(yù)后。

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(收稿日期：2014-11-28)

中圖分類號(hào)：R563

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)11-0032-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.11.011